背景^[1-3]

NP-40裂解液是一種用于細(xì)胞組織裂解的試劑，主要成分為50mM Tris（pH7.4）、150mM NaCl、1%NP-40，以及其他一些抑制劑，如sodium pyrophosphate、β-glycerophosphate、sodium orthovanadate、sodium fluoride、EDTA和leupeptin等。這些成分共同作用，可以有效抑制蛋白降解，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的完整性和活性。

NP-40是一種非離子型去垢劑，具有兩親結(jié)構(gòu)，能夠破壞細(xì)胞膜，但對(duì)核膜的破壞作用較弱。因此，NP-40裂解液在裂解細(xì)胞時(shí)，能夠提取胞漿蛋白，同時(shí)保留部分核蛋白。此外，NP-40與蛋白結(jié)合力強(qiáng)，能夠防止物質(zhì)分子疏水間相互作用，確保蛋白的充分溶解和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

NP-40裂解液

由于NP-40裂解液的性質(zhì)較為溫和，因此它常被用于需要保持蛋白質(zhì)功能完整的實(shí)驗(yàn)，如Western blot、免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（co-IP）、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和酶活力測(cè)定等。同時(shí)，由于其含有較高濃度的去垢劑，不能使用Bradford法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度，但可以使用其他方法，如BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒來測(cè)定蛋白濃度。

在使用NP-40裂解液時(shí)，需要注意適當(dāng)分裝后使用，并遵循產(chǎn)品說明書中的操作規(guī)范。同時(shí)，由于裂解液中的成分可能對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，因此在使用前需要充分了解和評(píng)估其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

應(yīng)用^[4-5]

NP-40裂解液可以用于FBXL16通過促進(jìn)LATS1/2的泛素化抑制Hippo信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為

FBXL16(F-box and leucine-rich repeat protein 16)是F-box蛋白家族的成員之一,目前,FBXL16在惡性腫瘤中的作用還研究甚少,基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示,與正常乳腺組織相比,FBXL16在乳腺癌組織中高表達(dá),且與FBXL16高表達(dá)者相比,FBXL16低表達(dá)組乳腺癌患者生存率升高。Genemania,Hitpredict等網(wǎng)站均預(yù)測(cè)FBXL16可能與LATS2之間存在蛋白質(zhì)互作關(guān)系,且置信度較高,而LATS2激酶及其同源物L(fēng)ATS1是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,因此我們提出假說FBXL16能否通過與LATS1/2的相互作用,調(diào)控它們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路活性,影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

細(xì)胞蛋白提取實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染或干擾48h后,收取細(xì)胞沉淀?？偟鞍滋崛〖尤隢P-40裂解液(該裂解液中已提前加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑,比例為100:1:1),冰上裂解30分鐘,使用低溫(4℃)高速離心機(jī)以12000rpm的速率離心20分鐘,所得上清即為總蛋白。在每20μl細(xì)胞沉淀物中加入200μl添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A,渦旋5秒,使細(xì)胞沉淀分散,冰浴10分鐘,加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10μl,渦旋5秒,冰浴1分鐘,渦旋5秒,低溫(4℃)高速離心機(jī)以12000rpm的速率離心5分鐘,所得上清即為漿蛋白。將上述沉淀用濾紙完全吸盡殘余上清,加入50μl添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白提取試劑,渦旋至細(xì)胞沉淀完全分散開,放入冰浴中,每隔1-2分鐘渦旋15-30秒,共30分鐘,低溫(4℃)高速離心機(jī)以12000rpm的速率離心10分鐘,所得上清即為核蛋白。

為了明確FBXL16與LATS1、LATS2的相互作用關(guān)系以及FBXL16對(duì)LATS1、LATS2泛素化水平的影響,我們進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),收取總蛋白,每組蛋白裂解液中加入20μl混勻的Protein A+G磁珠,4℃旋轉(zhuǎn)搖床上孵育2小時(shí)封閉處理,吸取上清。每1mg蛋白中加入1μg特異性一抗或相同屬性的Ig G抗體,4℃旋轉(zhuǎn)搖床上孵育過夜。18-24小時(shí)后加入Protein A+G磁珠,4℃旋轉(zhuǎn)搖床上孵育4-6小時(shí),低溫(4℃)離心機(jī)以1000rpm速率離心10分鐘,棄除上清,用NP-40裂解液將沉淀清洗三次,所得免疫復(fù)合物中加入相同體積的2×SDS loading緩沖液使其終濃度為1×,沸水煮10分鐘使蛋白充分變性,進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

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[3]Downregulated F-Box/LRR-Repeat Protein 7 Facilitates Pancreatic Cancer Metastasis by Regulating Snail1 for Proteasomal Degradation[J].Tang Liang;Ji Meng;Liang Xing;Chen Danlei;Liu Anan;Yang Guang;Shi Ligang;Fu Zhiping;Shao Chenghao.Frontiers in Genetics,2021

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[5]孫明芳.FBXL16通過促進(jìn)LATS1/2的泛素化抑制Hippo信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[D].中國醫(yī)科大學(xué),2023.