背景^[1-3]

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4ˊ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride）是一種常用的熒光染料，主要用于細(xì)胞核的染色。它能夠與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的AT堿基對結(jié)合，從而在熒光顯微鏡下產(chǎn)生強烈的藍(lán)色熒光，使得細(xì)胞核清晰可見。

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽的使用方法通常如下：

細(xì)胞固定：首先，需要將細(xì)胞固定在載玻片上，這通常通過使用甲醛或甲醇等固定劑來實現(xiàn)。

洗滌：用PBS（磷酸鹽緩沖液）或其他適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞，以去除固定劑和其他雜質(zhì)。

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色：將4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽溶液（通常稀釋在PBS中）滴加到細(xì)胞樣本上，確保細(xì)胞被完全覆蓋。4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽的染色濃度和染色時間可以根據(jù)不同的細(xì)胞類型和實驗需求進(jìn)行調(diào)整。

再次洗滌：染色完成后，用PBS洗滌細(xì)胞，以去除未結(jié)合的4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染料。

封片：使用抗熒光淬滅封片劑封片，以防止熒光淬滅。

觀察：在熒光顯微鏡下觀察樣本，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色的細(xì)胞核應(yīng)呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光。

需要注意的是，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽是一種有毒物質(zhì)，使用時應(yīng)在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，并佩戴適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)裝備。同時，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽的熒光強度可能會隨時間而減弱，因此建議染色后盡快進(jìn)行觀察。

此外，4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽的熒光激發(fā)波長通常在358nm左右，發(fā)射波長在461nm左右，因此在使用熒光顯微鏡時，需要設(shè)置合適的激發(fā)和發(fā)射波長來觀察4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽的熒光信號。

應(yīng)用^[4-5]

4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽可以用于基于PP2A/PP5/AMPK-JNK信號通路的異甘草酸鎂/二甲雙胍抗鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機制研究

研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、RNA干擾、Western Blot分析、蛋白熒光標(biāo)記、HE染色、4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽和TUNEL染色、臺盼藍(lán)染色、細(xì)胞活性分析等細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)與方法,以ICR小鼠以及L02細(xì)胞、AML-12細(xì)胞、PC12細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞和小鼠原代神經(jīng)元為實驗對象,通過建立的鎘染毒體內(nèi)和體外模型,綜合研究了異甘草酸鎂和二甲雙胍分別在抗鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用,深入解析了異甘草酸鎂和二甲雙胍分別通過調(diào)控ROS介導(dǎo)PP2A-JNK和PP5/AMPK-JNK信號通路發(fā)揮抗肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡分子機理。

結(jié)果如下:1異甘草酸鎂通過抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞JNK通路激活抗凋亡L02和AML-12細(xì)胞、或分別感染Ad-GFP、Ad-dn-c-Jun的L02或AML-12細(xì)胞用異甘草酸鎂(10-104μg/ml或100-800μg/ml或400μg/ml)預(yù)處理4 h,或用SP600125(20μM)預(yù)處理1 h后再用異甘草酸鎂(400μg/ml)預(yù)處理4 h,接著鎘(50μM)處理6 h或24 h。然后,觀察細(xì)胞形態(tài)、臺盼藍(lán)染色統(tǒng)計活細(xì)胞數(shù)量、4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽和TUNEL染色評估細(xì)胞凋亡表現(xiàn)、Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,異甘草酸鎂顯著阻止鎘引起的L02和AML-12細(xì)胞形態(tài)皺縮、細(xì)胞活力下降、Cleaved-PARP表達(dá)水平升高和細(xì)胞凋亡增加;異甘草酸鎂阻滯鎘激活JNK通路抗肝細(xì)胞凋亡,這被JNK抑制劑SP600125和鈍化c-Jun表達(dá)強化異甘草酸鎂抗鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞活性下降和凋亡的證據(jù)支持。提示:異甘草酸鎂通過抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞JNK通路激活抗凋亡。

2異甘草酸鎂抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞ROS依賴的PP2A-JNK信號通路抗凋亡L02和AML-12細(xì)胞、或分別感染Ad-GFP、Ad-PP2A-wt的L02或AML-12細(xì)胞用10-104μg/ml或100-800μg/ml異甘草酸鎂預(yù)處理4 h、或用5 m M乙酰半胱氨酸或100 n M岡田酸預(yù)處理1 h后再用400μg/ml異甘草酸鎂預(yù)處理4 h,接著鎘(50μM)處理6 h、12 h或24 h。使用CM-H2DCFDA探針檢測細(xì)胞ROS水平、臺盼藍(lán)染色統(tǒng)計活細(xì)胞數(shù)量、4ˊ,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色評估細(xì)胞凋亡表現(xiàn)、Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,異甘草酸鎂逆轉(zhuǎn)鎘和/或?qū)锼嵴T導(dǎo)的肝細(xì)胞PP2A失活、JNK激活和凋亡;過表達(dá)PP2A強化異甘草酸鎂抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞JNK激活依賴的凋亡;異甘草酸鎂抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞ROS產(chǎn)生;乙酰半胱氨酸增強異甘草酸鎂抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞ROS依賴的PP2A-JNK通路抗凋亡。提示:異甘草酸鎂抑制鎘誘導(dǎo)肝細(xì)胞ROS依賴的PP2A-JNK信號通路抗凋亡。

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