背景^[1-3]

T98G是一種源自人腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系經(jīng)常被用作生物醫(yī)學(xué)研究中的模型系統(tǒng)，特別是在神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物篩選和基因治療等領(lǐng)域。T98G細(xì)胞系的特點(diǎn)包括快速生長(zhǎng)、易于培養(yǎng)和具有某些特定的基因表達(dá)模式。

T98G細(xì)胞系的來(lái)源可以追溯到1970年代，當(dāng)時(shí)科學(xué)家們從一名患有惡性膠質(zhì)瘤的患者的腫瘤組織中分離出了這些細(xì)胞。這些細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室條件下能夠持續(xù)傳代，并保持一定的遺傳穩(wěn)定性，因此被廣泛用于科學(xué)研究。

在生物醫(yī)學(xué)研究中，T98G細(xì)胞系常被用來(lái)模擬人腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和侵襲行為，以及研究膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。此外，T98G細(xì)胞系也常被用作藥物篩選的模型，以評(píng)估潛在抗癌藥物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用。

然而，值得注意的是，雖然T98G細(xì)胞系在研究中具有一定的代表性，但它并不能完全模擬真實(shí)的人體環(huán)境。因此，在將實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于臨床之前，還需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究。

T98G

T98G細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇T98G細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)T98G細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)T98G細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

T98G可以用于DUSP10基因敲降T98G細(xì)胞系構(gòu)建及其對(duì)細(xì)胞功能的影響

探究了DUSP10在膠質(zhì)瘤和正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)差異,并通過(guò)慢病毒沉默DUSP10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá),分析DUSP10對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G增殖能力、遷移能力和凋亡的影響。

[方法]一.通過(guò)生物信息學(xué)相關(guān)知識(shí),初步探究DUSP10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)差異,利用TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存曲線分析,研究DUSP10與膠質(zhì)瘤的相關(guān)性。

二. 運(yùn)用RT-q PCR和Western blot技術(shù)對(duì)HAC/T98G/U251/U87細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè),分別從基因和蛋白水平層面來(lái)驗(yàn)證DUSP10在各膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平差異。

三. 通過(guò)酶切,連接、轉(zhuǎn)化、抽提等方法構(gòu)建出具有沉默DUSP10作用的pLK0.1質(zhì)粒載體,使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)T98G細(xì)胞系的DUSP10 RNA進(jìn)行干擾,設(shè)置熒光陽(yáng)性對(duì)照組,驗(yàn)證病毒包裝和轉(zhuǎn)染情況,并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的T98G細(xì)胞株,運(yùn)用RT-q PCR和Western blot方法分別從基因和蛋白水平來(lái)驗(yàn)證膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G經(jīng)干擾后的敲降的效果。

四. 將膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G分為shRNA-blank組、shRNA-NC組shRNA-DUSP10-1組、shRNA-DUSP10-2組,使用Cell Counting Kit 8(CCK-8)試劑檢測(cè)法、Transwell小室遷移測(cè)定、流式細(xì)胞儀檢測(cè)等試驗(yàn)技術(shù),對(duì)以上各組細(xì)胞生物功能進(jìn)行檢測(cè),分析DUSP10對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G增殖、遷移、凋亡方面的影響。

五. 試驗(yàn)采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖,P<0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

[結(jié)果]DUSP10在不同的膠質(zhì)瘤WHO分型中表達(dá)量存在差異,隨著WHO分型的增高,DUSP10的表達(dá)量也隨之升高(P<0.05),并在患者生存性分析中,與DUSP10低表達(dá)相比,DUSP10高表達(dá)呈現(xiàn)出低生存率趨勢(shì)(P<0.05)。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞,再經(jīng)嘌呤霉素篩選與熒光對(duì)照組試驗(yàn)對(duì)照表明,慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系構(gòu)建成功。經(jīng)Real-timePCR和WesternBlot試驗(yàn)檢測(cè),與shRNA-blank組和shRNA-NC組相比,shRNA-DUSP10-1組和shRNA-DUSP10-2組細(xì)胞DUSP10的表達(dá)下降(P<0.05),結(jié)果表明RNA干擾效果成功;CCK8試驗(yàn)檢測(cè)并繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn),沉默DUSP10后T98G的增殖活性在第二、三天明顯下降(P<0.05);

通過(guò)Transwell法來(lái)檢測(cè)各不同組T98G的遷移能力,我們發(fā)現(xiàn)shRNA-blank組和shRNA-NC組、shRNA-DUSP10-1組、shRNA-DUSP10-2組透過(guò)小室細(xì)胞均有意義,各組每個(gè)視野細(xì)胞分別為64±4個(gè)、61±5個(gè)、21±4個(gè)和19±4個(gè),與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,DUSP10兩個(gè)干擾組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少,差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01);經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:shRNA-blank組、shRNA-NC組shRNA-DUSP10-1組、shRNA-DUSP10-2組的晚期凋亡率分別為(4.79±0.68)%、(5.13±1.03)%和(8.94±0.7)%,(8.98±0.85)%,DUSP10干擾組的晚期凋亡率比空白組和陰性對(duì)照組明顯增加,差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).

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