背景[1-7]
人源化單克隆抗體開發(fā)主要指鼠源單克隆抗體以基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達的抗體，其大部分氨基酸序列為人源序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性，有利應用于人體。由于目前臨床上使用的單抗多數(shù)為鼠源性單抗，容易產(chǎn)生HAMA反應（人抗鼠抗體反應），存在一定風險，這使得鼠源單抗在臨床治療中的應用受到很大的限制。
抗體人源化已成為將鼠源抗體轉(zhuǎn)化為有效安全的治療藥物的重要方式，人源抗體藥物開發(fā)也成為各大藥企爭相研發(fā)的熱點。轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體的實驗原理是：在抗體生成過程不是從普通小鼠開始，而是從鼠抗體生成基因被相應人基因所取代的小鼠開始。該方法要求人的抗體基因片段在小鼠體內(nèi)必須進行較為有效的重排與表達，并且這些片段能與小鼠細胞的免疫系統(tǒng)信號機制相互作用，使得小鼠在受抗原刺激后，這些人抗基因片段能被選擇，表達并活化B細胞分泌人抗體。
其基本方法是采用在鼠胚胎干細胞（ES）中的同源重組來使得鼠原有基因缺失，再通過顯微注射等技術(shù)將重建的人源抗體胚系基因微位點轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，最終由mAb的雜交瘤分泌出全人序列的抗體。該方法的特點是外源基因的導入整合效率較高，不需要載體，直接轉(zhuǎn)移目的基因，目的基因的長度可達200kb，較少產(chǎn)生嵌合體等。它可以直接獲得純系，所以實驗周期短。然而該方法有一些缺點使其很難在大動物中廣泛應用：
(1)顯微操作儀器昂貴；
(2) 技術(shù)操作復雜，要求經(jīng)過專門訓練的技術(shù)人員操作儀器；
(3) 顯微注射導入的外源基因在基因組中隨機整合，可能導致內(nèi)源性功能基因突變或者激活一些致癌基因，無法調(diào)控外源基因在基因組中的整合數(shù)目(拷貝數(shù))
(4)外源基因整合效率較低，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大動物成本較高；
(5)只能實現(xiàn)目的基因的整合，不能進行基因敲除研究。盡管如此，在體細胞核移植技術(shù)出現(xiàn)前，顯微注射法是被廣泛使用和效果的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
轉(zhuǎn)基因小鼠制備全人源抗體的主要優(yōu)點是，其功效要優(yōu)于其他生產(chǎn)抗正常人體蛋白mAb技術(shù)。小鼠識別抗原和動員抗該抗原的抗體系統(tǒng)仍保持完整，容易把人體蛋白識別為異物。而且，由于抗體是在體內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)歷正常裝配和成熟過程，從而保證成品具有較高的靶結(jié)合親和力。
另一方面，用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)候選mAb藥物時間較短，費用較低。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)目前主要存在以下幾個問題。一是免疫耐受的問題，雖然可以通過免疫佐劑的使用和免疫方法的改進來提高免疫反應強度，但對于一些人類抗原仍然較難獲得高親和力抗體；二是上述提到的存在鼠源抗體干擾的問題；三是存在對毒性抗原較難進行免疫等問題。
應用[8][9]
人源化單克隆抗體開發(fā)可用于抗腫瘤作用的藥效學研究：
在重組抗HER2人源化單克隆抗體抗腫瘤作用的藥效學研究中利用MTT試驗法分別檢測受試藥在體外各暴露濃度對不同HER2表達量的人乳腺癌細胞以及人胃癌細胞的生長抑制效應與陽性藥物赫賽汀的生長抑制作用。
用ORIGIN50軟件進行數(shù)據(jù)的整理與細胞生長曲線的繪制,得出半效抑制濃度(IC50,μg·ml-1)和實測抑制率(Imax,%),進行比較。復蘇擴增相關(guān)細胞,消化收集腫瘤細胞,按照每只裸鼠接種一定數(shù)量的腫瘤細胞于裸鼠皮下,建立裸鼠移植瘤模型。按腫瘤體積隨機將裸鼠分組并開始給藥,給藥途徑為尾靜脈注射。每2-3天測量裸鼠體重并用游標卡尺測量腫瘤長短徑數(shù)據(jù),給藥后觀察2周左右,試驗結(jié)束時,頸部脫臼處死動物,剝離取出瘤塊稱重,拍照,依據(jù)腫瘤瘤重和相對體積的變化評價藥物療效。
最后,通過免疫組織化學染色法檢測MCF-7、MDA-MB-231、MS-1、BT474、Bcap37、MS-1等人乳腺癌細胞以及SGC7901人胃癌細胞這些受試細胞膜上的HER2受體表達情況。重組抗HER2人源化單克隆抗體進行了系統(tǒng)的體內(nèi)體外藥效學評價,評價結(jié)果顯示該重組抗HER2人源化單克隆抗體對于各類HER2高表達的腫瘤細胞的抑制生長作用都非常顯著,與陽性對照藥物赫賽汀、紫杉醇作用相似。
參考文獻
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[9]孫志偉,王雙,陳惠鵬.轉(zhuǎn)基因小鼠在抗體藥物研發(fā)中的應用.軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所,2012