背景^[1-3]

HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系是一種來源于胸部乳腺的上皮樣細(xì)胞系。這種細(xì)胞系是從一名60歲的黑人女性患者的乳腺中分離出來的，該患者患有TNM IIB期2級棘層松解性鱗狀細(xì)胞癌（ASCC）。

HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系于1995年啟動，花了10個月的時(shí)間來建立。這種細(xì)胞系具有貼壁生長的特性，是一種較為常見的細(xì)胞系，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，以探索乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，以及尋找治療乳腺癌的新藥物和新方法等。

在研究過程中，研究人員可以通過對HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系的基因表達(dá)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面進(jìn)行深入研究，從而進(jìn)一步了解乳腺癌的生物學(xué)特性，為臨床治療提供理論依據(jù)。

HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系

HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系可以用于MicroRNA-139-5p靶向調(diào)節(jié)SOX8抑制三陰性乳腺癌的機(jī)制研究

SOX8及miR-139-5p在腫瘤調(diào)控中發(fā)揮的作用,有必要在TNBC中進(jìn)一步探討SOX8和miR-139-5p的關(guān)系,并尋找兩者的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究目的本研究旨在探討miR-139-5p對TNBC病理發(fā)生和發(fā)展的調(diào)節(jié)作用,并探討miR-139-5p通過調(diào)控SOX8表達(dá),抑制TNBC發(fā)展的分子機(jī)制,為TNBC的診斷和治療中新的生物標(biāo)志物及靶點(diǎn)的探索提供理論基礎(chǔ)。

研究方法1.研究SOX8在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)模式實(shí)驗(yàn)選取兩種常用的人類TNBC細(xì)胞系(HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549),分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡方法(Western blot)檢測其中SOX8在mRNA和蛋白水平上的相對表達(dá)量。

2. 研究SOX8基因?qū)θ幮匀橄侔┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響通過在HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染SOX8過表達(dá)質(zhì)?；騧icroRNA-SOX8特異性短發(fā)夾RNA來增強(qiáng)或敲減基因表達(dá),再用定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中SOX8 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量,判斷過表達(dá)和干擾的效率高低。隨后分別進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成和Transwell實(shí)驗(yàn),用于測定HCC1806和BT549細(xì)胞的活力、克隆形成能力和遷移情況,評估SOX8基因表達(dá)量改變對TNBC細(xì)胞增殖和遷移的影響。

3. SOX8對三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞干性形成的影響利用流式細(xì)胞分析SOX8過表達(dá)或干擾后,HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549細(xì)胞凋亡的變化情況,同時(shí)用Western blot檢測凋亡標(biāo)志物Caspase3、Caspase9的表達(dá)水平。用體外成球?qū)嶒?yàn)鑒定兩種腫瘤細(xì)胞自我更新能力即細(xì)胞的干性。

4. 過表達(dá)SOX8對Wnt/β-catenin通路活性影響利用Targetscan、Starbase等網(wǎng)絡(luò)軟件,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測出SOX8可能與Wnt通路受體FZD7的互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn),通過RT-PCR驗(yàn)證過表達(dá)SOX8對FZD7轉(zhuǎn)錄的影響。

5. miR-139-5p對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響利用定量PCR檢測miR-139-5p在HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)量。分別在兩種細(xì)胞中過表達(dá)miR-139-5p,觀察miR-139-5p表達(dá)量,以及SOX8 mRNA和蛋白的表達(dá)量與未轉(zhuǎn)染組相比發(fā)生的變化,從而揭示二者的關(guān)系。通過CCK-8、克隆形成、Transwell實(shí)驗(yàn)研究miR-139-5p過表達(dá)對細(xì)胞增殖和遷移的影響。6.miR-139-5p對三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡及腫瘤球形成的影響分別在HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549細(xì)胞中過表達(dá)miR-139-5p,流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡率,Western blot檢測活性Caspase3、Caspase9表達(dá)量,用體外腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測細(xì)胞干性。

研究結(jié)果1.三陰性乳腺癌細(xì)胞系中SOX8表達(dá)上調(diào)與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A相比,SOX8 mRNA、蛋白在HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量均明顯上調(diào)(P<0.05)。

2.SOX8可以促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移與對照組相比,在轉(zhuǎn)染microRNA-SOX8特異性短發(fā)夾RNA的HCC1806人乳腺鱗狀癌細(xì)胞系和BT549細(xì)胞中SOX8 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05);而過表達(dá)組細(xì)胞中SOX8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05)。結(jié)果表明SOX8基因過表達(dá)和干擾的效率較高,轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建成功。過表達(dá)SOX8的HCC1806和BT549細(xì)胞的存活率與對照組細(xì)胞相比大幅提高(P<0.05);同時(shí),SOX8過表達(dá)后,兩種細(xì)胞的相對克隆數(shù)增加(P<0.05),表明TNBC細(xì)胞克隆能力增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在SOX8過表達(dá)后,細(xì)胞遷移能力顯著增加(P<0.05);另一方面,轉(zhuǎn)染microRNA-SOX8特異性短發(fā)夾RNA的細(xì)胞顯示出相反的結(jié)果。由此可知SOX8基因可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖和遷移。

參考文獻(xiàn)

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