背景[1-7]
DNA pulldown試劑盒利用預(yù)先使用BSA、寡核苷酸隨機(jī)引物封閉磁珠，降低了磁珠與蛋白、基因組DNA的非特異性結(jié)合。DNA pulldown技術(shù)是一種用于研究DNA與蛋白質(zhì)互作的技術(shù)，通常用來分析目標(biāo)基因調(diào)控區(qū)域相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其他調(diào)控蛋白。針對目標(biāo)區(qū)域設(shè)計脫硫生物素標(biāo)記的特異性DNA探針，并與細(xì)胞核提取物孵育。
通過偶聯(lián)磁珠，經(jīng)洗脫，得到目的DNA探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物。最后采用Western Blot或質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)類型。隨著功能基因組學(xué)的興起，蛋白質(zhì)-DNA相互作用的研究變得越來越重要。蛋白質(zhì)-DNA相互作用涉及很多生物學(xué)功能，如基因調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)和DNA重組現(xiàn)有研究DNA-蛋白相互作用的技術(shù)方案有多種，如酵母單雜交(Y1H)方法、ChIP-seq方法、凝膠遷移實(shí)驗(EMSA)和DNA pulldown方法。
DNA pulldown方法是一種非常重要的蛋白質(zhì)-DNA相互作用的研究方法。該方法可以在同一個樣品中分離DNA-蛋白復(fù)合體。通常，是通過高親和性的標(biāo)簽(如生物素)標(biāo)記DNA，標(biāo)簽的目的是固定DNA，通過瓊脂糖珠子或磁珠可以分離出生物素化的DNA，從而分離出細(xì)胞裂解液中的DNA-蛋白復(fù)合體。分離出的蛋白進(jìn)行洗脫后可以通過Western Blot進(jìn)行檢測，或通過質(zhì)譜進(jìn)行篩選。
步驟：
1、磁珠預(yù)處理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸隨機(jī)引物封閉鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠；
2、制備探針?磁珠復(fù)合物；
3、提取并預(yù)處理細(xì)胞核蛋白：向提取核蛋白樣品中加入脫氧核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；
4、pulldown；
5、蛋白樣品的收集。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.快速省時：從標(biāo)記探針到結(jié)果分析，全部實(shí)驗只需3小時。
2.穩(wěn)定可靠：DNA末端標(biāo)記生物素，不影響蛋白結(jié)合位點(diǎn)。標(biāo)記好的DNA可以保存一年。
3.配備完整：該試劑盒包括對照系統(tǒng)，只需要自備生物素末端標(biāo)記的DNA探針及核蛋白質(zhì)樣品。
4.可得到完整、高濃度蛋白，用于質(zhì)譜檢測。
應(yīng)用[8]
DNA pulldown試劑盒可用于基于熒光信號放大技術(shù)的蛋白質(zhì)和核酸檢測方法研究：
利用信號雙重擴(kuò)增(DNA擴(kuò)增、SYBR Green I/BT-DNA結(jié)合物熒光信號擴(kuò)增)結(jié)合磁分離技術(shù),利用落射熒光顯微術(shù)建立了一種超靈敏的靶蛋白熒光免疫測定方法。在高濃度時,熒光強(qiáng)度與靶抗原在5.0×10-13～8.0×10-15mol L-1的濃度對數(shù)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。在低濃度時,一個功能化得磁納米球?qū)?yīng)一個蛋白分子,這時通過計數(shù)單個磁納米球定量檢測單個生物分子。
磁納米球的數(shù)目和抗體的濃度在8.0×10-14～3.0×10-15mol L-1的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。這個實(shí)驗設(shè)計了一種啞鈴型的RCA模版、將卟啉衍生物(NMM)與RCA的產(chǎn)物(雙向G-四倍體DNA)相互作用,發(fā)展了一種快速、簡便、高靈敏的基于啞鈴型探針誘導(dǎo)RCA擴(kuò)增輔助的G-四倍體免標(biāo)記熒光信號放大策略超靈敏檢測DNA。
參考文獻(xiàn)
[1] ROHS R,JIN X,WEST S M,et al.2010.Origins of specificity in protein-DNA recognition.Annu Rev Biochem[J],79:233-269。
[2] An Autonomous Bio‐barcode DNA Machine for Exponential DNA Amplification and Its Application to the Electrochemical Determination of Adenosine Triphosphate[J].HuiZhang,CongcongFang,ShushengZhang.Chemistry–A European Journal.2010(41)
[3] Fluorescence single-molecule counting assays for protein quantification using epi-fluorescence microscopy with quantum dots labeling[J].Dafeng Jiang,Chunxia Liu,Lei Wang,Wei Jiang.Analytica Chimica Acta.2010(2)
[4] A Quadruplex‐Based,Label‐Free,and Real‐Time Fluorescence Assay for RNase?H Activity and Inhibition[J].DanHu,FangPu,ZhenzhenHuang,JinsongRen,XiaogangQu.Chemistry–A European Journal.2010(8)
[5] Ultrasensitive electrochemical immunoassay based on counting single magnetic nanobead by a combination of nanobead amplification and enzyme amplification[J].Jia Chen,Guizheng Zou,Xiaoli Zhang,Wenrui Jin.Electrochemistry Communications.2009(7)
[6] Chemiluminescence flow biosensor for hydrogen peroxide using DNAzyme immobilized on eggshell membrane as a thermally stable biocatalyst[J].Weiwei Chen,Baoxin Li,Chunli Xu,Lei Wang.Biosensors and Bioelectronics.2009(8)
[7] Rolling Circle Amplification:Applications in Nanotechnology and Biodetection with Functional Nucleic Acids[J].Angewandte Chemie International Edition.2008(34)
[8] 薛慶旺.基于熒光信號放大技術(shù)的蛋白質(zhì)和核酸檢測方法研究[D].山東大學(xué),2012.