背景[1-3]
MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系是一種來源于人類乳腺癌的細胞系，它最初是由美國國立癌癥研究所(NCI)于1970年代從一名患有乳腺癌的女性體內分離出來的。這種細胞系在實驗室中被廣泛用于研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療。
MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系
MDA-KB2細胞系的特點包括：
貼壁生長：MDA-KB2細胞系可以在含有血清的培養(yǎng)基中貼壁生長，形成單層或多層的細胞群落。
異質性：MDA-KB2細胞系具有較高的異質性，即不同克隆的細胞在形態(tài)、生長速度和基因表達等方面存在差異。
耐藥性：MDA-KB2細胞系對多種化療藥物具有耐藥性，這使得它成為研究乳腺癌耐藥機制的重要工具。
基因突變：MDA-KB2細胞系中存在多個已知的致癌基因突變，如TP53、PIK3CA等。這些突變可能與該細胞系的惡性轉化有關。
MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系細胞培養(yǎng)操作
1)復蘇MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應用[4-5]
MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系可以用于鄰苯二甲酸酯類化學物的內分泌干擾效應
利用受體介導的報告基因試驗檢測鄰苯二甲酸酯類化學物內分泌干擾效應
應用雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)以及甲狀腺激素受體(TR)介導的MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系報告基因試驗檢測三種鄰苯二甲酸酯類化學物:鄰苯二甲酸乙基己基酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)的擬或(抗)雌激素、雄激素和甲狀腺激素活性,并對三種化學物的激素干擾效應進行比較。
方法1.雌激素受體介導的報告基因試驗:將表達大鼠ERα的質粒rERα/pCI與重組Luc報告基因質粒pERE-aug-Luc共轉染CV-1細胞。根據(jù)受試化學物能否誘導Luc的表達,以及能否拮抗E2誘導的Luc的表達,判斷受試化學物的ER激動和拮抗效應。
2. 雄激素受體介導的報告基因實驗:應用穩(wěn)定轉染了pMMTV-Luc的MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系,將受試化學物單獨染毒細胞,以及與AR拮抗劑氟他胺(Flu)共同染毒,檢測Luc的表達情況,判斷受試化學物的AR激動效應,將受試化學物與雙氫睪酮(DHT)共同染毒,檢測其AR拮抗效應。
3. 甲狀腺激素受體介導的報告基因試驗:將表達人TRβ配體結合域和Gal4-BD(酵母轉錄因子結合域)融合蛋白的質粒pGal4-L-TRβ與Gal4反應的報告基因質粒pUAS-tk-luc共轉染CV-1細胞,根據(jù)該物質能否誘導Luc的表達以及拮抗T3誘導的Luc表達,判斷受試化學物的TR激動作用和拮抗作用。
結果1.雌激素受體介導的報告基因試驗:三種鄰苯二甲酸酯類化學物中DEHP和MBP幾乎不能誘導Luc的表達,與對照組相比無統(tǒng)計學差異,DBP在高濃度能誘導Luc的表達,最高誘導倍數(shù)為溶劑對照的2.6倍。三種鄰苯二甲酸酯類化學物均無法抑制10-9 M E2所誘導的Luc表達。
2. 雄激素受體介導的報告基因實驗:DBP、MBP和DEHP均可以誘導MDA-KB2人正常乳腺貼壁細胞系Luc的表達,EC50分別為6.17×10-6、1.13×10-5和大于10-4 M。將三種化學物與10-5 M Flu共同染毒,三種化學物誘導的Luc表達均被抑制。代謝產物MBP比DBP表現(xiàn)出更強的活性。DBP、MBP和DEHP均能抑制10-9 M DHT所誘導的Luc的表達,IC50分別為1.05×106、1.22×107和大于104 M,抑制效應強度:DEHP<DBP<MBP。
3. 甲狀腺激素受體介導的報告基因試驗:DBP、MBP和DEHP均能抑制5×10-9 M T3所誘導的Luc的表達,IC50分別為1.31×105,2.77×106和大于104 M,三種化學物的抑制效應強度:DEHP<DBP<MBP。三種鄰苯二甲酸酯類化學物均不能誘導Luc的表達。
結論1.所研究的三種鄰苯二甲酸酯類化學物中DEHP、MBP無擬雌激素活性,DBP表現(xiàn)出較弱的擬雌激素活性。該三種化學物均無抗雌激素活性。
2. 三種鄰苯二甲酸酯類化學物均具有擬雄激素活性,其活性強度:DEHP<DBP<MBP,其中代謝產物MBP表現(xiàn)出比原型DBP更強的擬雄激素活性。三種鄰苯二甲酸酯類化學物均具有抗雄激素活性,其活性強度:DEHP<DBP<MBP,其中代謝產物MBP表現(xiàn)出比原型DBP更強的抗雄激素活性。
3. 三種鄰苯二甲酸酯類化學物均具有抗甲狀腺激素活性,其活性強度:DEHP<DBP<MBP,其中代謝產物MBP表現(xiàn)出比原型DBP更強的抗甲狀腺激素活性。三種鄰苯二甲酸酯類化學物均無擬甲狀腺激素活性。
參考文獻
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