背景[1-7]
ChIRP（Chromatin Isolation by RNA Purification）試劑盒運(yùn)用于研究RNA與DNA、RNA及蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)研究對(duì)象不同，ChIRP技術(shù)結(jié)合了高通量測(cè)序（ChIRP-Seq）和質(zhì)譜技術(shù)（ChIRP-MS）分別研究與目標(biāo)RNA互作的基因和蛋白質(zhì)。ChIRP技術(shù)是通過(guò)設(shè)計(jì)生物素探針組，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)將目標(biāo)RNA特異性拉下的同時(shí)會(huì)富集與其互作的DNA、RNA或蛋白質(zhì)（RBPs），最后將基因開(kāi)展高通量測(cè)序或PCR，可以得到該調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因。
與此同時(shí)，RBPs可以開(kāi)展Western Blot驗(yàn)證或者M(jìn)S鑒定。ChIRP是研究體內(nèi)RNA與蛋白互作的有力工具。該技術(shù)在特定時(shí)間點(diǎn)用甲醛交聯(lián)等方式固定細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白及核酸的互作復(fù)合物，再利用生物素標(biāo)記的探針及鏈霉親和素磁珠純化出靶RNA及其與它結(jié)合的蛋白、核酸復(fù)合物，復(fù)合物中的蛋白質(zhì)被洗脫下來(lái)western-blot，可以驗(yàn)證某個(gè)蛋白是否與靶RNA結(jié)合；洗脫下來(lái)的蛋白液做質(zhì)譜鑒定，即可篩選出與目的RNA結(jié)合的蛋白。
技術(shù)原理：生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用；其中活化生物素可以在蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的介導(dǎo)下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。ChIRP技術(shù)利用生物素標(biāo)記探針識(shí)別靶RNA，在純化靶RNA的同時(shí)將與它結(jié)合的蛋白也一并純化出來(lái)，洗脫得到靶RNA的結(jié)合蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)流程：
1.ChIRP探針設(shè)計(jì)合成
2.lncRNA復(fù)合物交聯(lián)
3.超聲打斷
4.探針雜交
5.DNA回收純化
6.測(cè)序分析
ChIRP試劑盒優(yōu)勢(shì)：
1.研究與LncRNA或其他染色質(zhì)相關(guān)RNA相互作用的蛋白或DNA。
2.有效的檢測(cè)與染色質(zhì)相關(guān)的RNA在基因組上的作用位點(diǎn)。
3.高特異性：利用evenodd捕獲探針消除非特異信號(hào)確保清晰的檢測(cè)到特異性相互作用。
4.高靈敏性：利用PureProteomeTM Streptavid in6磁珠進(jìn)行pull down。
5.操作簡(jiǎn)單方便：試劑盒提供了實(shí)驗(yàn)所需要的緩沖液，和試劑。
6.試劑盒中提供陰陽(yáng)性對(duì)照，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。
7.實(shí)驗(yàn)獲得的染色質(zhì)可用RT-qPCR,qPCR和二代測(cè)序等方法進(jìn)行檢測(cè)。
8.實(shí)驗(yàn)可獲取內(nèi)源性的lncRNA與染色質(zhì)的天然復(fù)合物，結(jié)果更加真實(shí)可信。
應(yīng)用[8]
ChIRP試劑盒可用于RNA結(jié)合蛋白在體內(nèi)條件下的驗(yàn)證和篩選。
例如在多能干細(xì)胞關(guān)鍵因子Oct4 RNA結(jié)合蛋白的分離與鑒定中先經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜法鑒定和篩選出121個(gè)能與Oct4 3’非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)和Oct45’UTR相結(jié)合的RNA結(jié)合蛋白,肽段圖譜匹配數(shù)≥2的有11個(gè)。再培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞(R1),從中提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增Oct4并轉(zhuǎn)錄為m RNA。采用鏈霉素親和層析和質(zhì)譜技術(shù)篩選候選RNA結(jié)合蛋白,采用ChIRP劑盒鑒定候選RNA結(jié)合蛋白。
參考文獻(xiàn)
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