背景及概述^[1]

《中華人民共和國藥典》中明確記載了蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍( Bufo bufo gargarizansCantor) 或黑眶蟾蜍( Bufo melanostictus Schneider) 的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液經(jīng)加工干燥而成。蟾酥性溫，味甘、辛，有毒，具有解毒、止痛、抗腫瘤等多種功效。臨床用于惡性腫瘤、止痛、麻醉、抗感染、白細胞減少癥、周圍性面神經(jīng)麻痹等，對肝癌、腸癌、白血病、皮膚癌等多種癌癥具有較好的療效。

蟾毒它靈是蟾酥中的主要化合物之一。眾多的研究發(fā)現(xiàn)蟾毒它靈具有良好的抗腫瘤活性，具有很大的藥物應(yīng)用開發(fā)前景。目前含有蟾毒它靈的口服液、片劑已應(yīng)用于臨床，對肝癌、肺癌、胃癌等具有較好的療效。蟾毒它靈毒性較大，口服后會產(chǎn)生全身性的毒副作用，而且由于肝臟的首過效應(yīng)，不利于藥物蓄積于腫瘤部位，因此起效慢，制劑的生物利用度較低。

結(jié)構(gòu)

藥理作用 ^[2]

蟾毒它靈具有很好的腫瘤細胞生長抑制活性，而且抗瘤譜廣泛。從蟾酥中分離得到蟾毒它靈等化合物，并利用MTT 法測試了蟾毒它靈等化合物對人腫瘤Hela 細胞的細胞毒活性，測得蟾毒它靈的半數(shù)抑制濃度IC50為0.11 μM。以原代肝癌細胞系PLC /PRF /5 ( PLC) 開展了蟾毒甾烯類化合物的活性與結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的研究，其中蟾毒它靈對PLC /PRF /5 ( PLC) 細胞的IC50為3.4 × 10-4μg /mL Nogawa，對人鼻咽癌Kb 細胞的IC50為0.19 μg /mL，對人類粒細胞白血病HL60 細胞的IC50 ＜ 0.01 μg /mL，對鼠白血病MH60 細胞的IC50 ＞ 25 μg /mL。開展蟾毒它靈對腫瘤細胞生長抑制研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟾毒它靈對人肝癌Hep 3B 細胞、人大腸癌HT-29 細胞和人乳腺癌MCF7 細胞給藥6 天的IC50分別為0.24 ± 0.02 μM，0 .23 ± 0.03 μM 和0.15 ±0.02 μM。基于蟾毒它靈良好的腫瘤細胞抑制活性，其作用機理引起廣泛關(guān)注，蟾毒它靈等蟾毒甾烯是與洋地黃相似的強心苷類化合物，能夠分化白血病細胞和黑色素瘤細胞。同。

考察蟾毒它靈對人胃癌BGC-823 細胞的細胞毒作用，發(fā)現(xiàn)蟾毒它靈能劑量依賴地抑制BGC-823 細胞的存活，在1 μM 時抑制率達到61%。通過對作用機理的研究發(fā)現(xiàn)，蟾毒它靈能呈劑量依賴性地使細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。蟾毒它靈呈劑量依賴性地促進了細胞的磷脂酰絲氨酸的外翻，表明蟾毒它靈誘導(dǎo)了細胞凋亡。在1 μM 濃度時，其促凋亡能力與10 μM 喜樹堿( CPT) 相當(dāng)。活化的caspase-3 僅在凋亡細胞中發(fā)現(xiàn)，在檢測活化的caspase-3 時發(fā)現(xiàn)蟾毒它靈能促進caspase-3 活性形式的增加。這表明蟾毒它靈促進BGC-823 細胞的凋亡可能通過caspase-3 通路。

蟾毒它靈對腫瘤細胞生長抑制的作用機理研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.13 μM 的蟾毒它靈能夠隨時間的增加顯著提高人肝癌Hep 3B 細胞sub-G1 期細胞的量，在24 h 時為10.0%，而72 h 時達到57.2%。當(dāng)0.45 μM 的蟾毒它靈給藥超過48h 時能夠檢測到DNA 碎片。利用Hoechst33258 染色后可以檢測到凋亡小體。信號通路可能經(jīng)由激活caspase-8，增加線粒體內(nèi)的tBid，降低線粒體膜電位，并且異位凋亡誘導(dǎo)因子( AIF ) 。活化的caspase-8 可能激活caspase-9 和caspase-3，導(dǎo)致核內(nèi)PARP 分裂。AIF 的存在和核內(nèi)分裂的PARP 可能導(dǎo)致DNA 斷裂。Caspase-8 抑制劑( Z-IETD) 或廣譜caspase 抑制劑( Z-VAD) 可以顯著抑制蟾毒它靈誘導(dǎo)的凋亡，而anti-Fas 中和抗體卻無效，這顯示蟾毒它靈誘導(dǎo)Hep 3B 細胞凋亡可能包括caspases 和AIF。

制備^[2]

在早期，通過傳統(tǒng)的柱分離方式或薄層色譜( TLC) 方式很難將蟾蜍甾烯進行分離。利用填充了Li-Chromprep Si-60 的Lobar B 柱可將這些蟾蜍毒素成功分離。此后以疏水凝膠Sephadex LH-20 及HP-cellulofine 為載體利用新的色譜方法分離得到了蟾毒它靈，并考察了Sephadex LH-20 及HPcellulofine柱層析對包括蟾毒它靈在內(nèi)的10 種蟾蜍甾烯的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用n-hexane /CH2Cl2 /MeOH ( 4∶ 5∶ 1) ，n-hexane /CHCl3 /MeOH ( 4∶ 5∶ 1) 和n-hexane /toluene /MeOH ( 3∶ 2∶ 1) 作為洗脫劑可以使蟾蜍甾烯得到很好分離。確定了流速、載體粒徑和柱長與分離效果的關(guān)系，此外還比較了Sephadex LH-20、HP-cellulofine 的分離狀況及與硅膠薄層色譜的關(guān)系。

在國內(nèi)，取蟾酥以甲醇回流提取，減壓濃縮，得甲醇干浸膏，環(huán)己烷萃取后的剩余浸膏以水混懸后氯仿萃取，得氯仿萃取物，硅膠拌樣，干法行硅膠柱色譜。用氯仿、氯仿-甲醇梯度洗脫，相關(guān)流份再干法拌樣行硅膠小柱色譜，其中的一個流份經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得蟾毒它靈。將中華大蟾蜍皮經(jīng)95%乙醇冷浸，浸膏的石油醚萃取部位經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，所得到的流份再通過反復(fù)硅膠柱、ODS 反相柱、制備液相等手段分離，得到了包括蟾毒它靈在內(nèi)的6 個化合物。隨著研究的深入，一些蟾毒它靈的衍生物也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。從蟾蜍皮中分離得到一個新的蟾蜍毒素，為蟾毒它靈3-丁二酰精氨酸酯。

主要參考資料

[1] CN201110147785.1 一種蟾毒它靈干粉吸入劑及其制備方法、應(yīng)用

[2] 蟾毒它靈的研究進展

[3] 蟾毒它靈體內(nèi)外抗腫瘤作用的研究