背景^[1-3]

NCI-H596是1983年由Gazdar·A·F和Oie·H從一名患有肺腺鱗癌的73歲白人男性患者的胸壁腫物中分離得到；腫塊的獲取先于治療。NCI-H596細(xì)胞表達(dá)與正常肺組織水平相當(dāng)?shù)膒53，沒(méi)有大的結(jié)構(gòu)DNA的異常。NCI-H596細(xì)胞角蛋白和波形蛋白陽(yáng)性，神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白陰性；NCI-H596細(xì)胞表達(dá)多種鱗狀細(xì)胞分化標(biāo)志，如谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活性、被膜素的產(chǎn)生和交聯(lián)包膜的形成。

NCI-H596

NCI-H596細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇NCI-H596細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）NCI-H596細(xì)胞傳代：如果NCI-H596細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察RL95-2細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打NCI-H596細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

3）NCI-H596細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

應(yīng)用^[4][5]

NCI-H596可以用于扶正抑癌1號(hào)方聯(lián)合吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌的臨床及作用機(jī)制研究

通過(guò)使用扶正抑癌1號(hào)方聯(lián)合吉非替尼,分析不同實(shí)驗(yàn)組的腫瘤抑制效果、各類腫瘤細(xì)胞在組織中的陽(yáng)性表達(dá)率以及蛋白表達(dá)水平,探索扶正抑癌1號(hào)方聯(lián)合吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌增效減毒的作用機(jī)制。

研究方法:1、Meta分析方面,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)收集的多個(gè)研究資料進(jìn)行概括和分析,收集以中西醫(yī)結(jié)合理論為指導(dǎo),中醫(yī)藥聯(lián)合EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn),對(duì)其疾病控制率為臨床療效進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),對(duì)同一問(wèn)題的多個(gè)研究結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的、定量的綜合性分析,用量化的平均效果來(lái)解釋研究的問(wèn)題。

2、臨床研究方面,采用多中心、隨機(jī)、對(duì)照試驗(yàn);對(duì)照組常規(guī)服用吉非替尼單藥,試驗(yàn)組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合扶正抑癌1號(hào)方,試驗(yàn)結(jié)束后,以RECIST標(biāo)準(zhǔn)、Karnofsky評(píng)分、中醫(yī)臨床癥狀評(píng)分、不良反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和安全指標(biāo)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),了解扶正抑癌1號(hào)方聯(lián)合吉非替尼是否優(yōu)于單用吉非替尼,中醫(yī)藥的配合應(yīng)用是否有增效減毒的作用。

3、實(shí)驗(yàn)研究方面,裸鼠接種人肺腺鱗癌NCI-H596細(xì)胞,造模成功后進(jìn)行分組灌胃給藥,觀察吉非替尼聯(lián)合不同濃度的扶正抑癌1號(hào)方的抑瘤重量率,抑瘤體積率,應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織的P63及TTF1的陽(yáng)性表達(dá)率,用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)了解各組腫瘤組織細(xì)胞P63和TTF1的蛋白表達(dá)水平,從而評(píng)估各組給藥對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響,闡釋扶正抑癌1號(hào)方聯(lián)合吉非替尼的增效機(jī)制與非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)分化的關(guān)聯(lián)性。

研究結(jié)果:1、Meta分析方面。通過(guò)對(duì)21篇文獻(xiàn)所報(bào)道的總有療效進(jìn)行研究,各文獻(xiàn)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性(P=0.92,I2=0),采用固定效應(yīng)模型合并效應(yīng)量分析,結(jié)果顯示,試驗(yàn)組患者的總有效率顯著高于對(duì)照組,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=2.22,95%CI(1.75,2.81),P<0.01]。選取疾病控制率為指標(biāo)繪制倒漏斗圖,顯示左右兩側(cè)的點(diǎn)估計(jì)值分布基本對(duì)稱,說(shuō)明不存在發(fā)表偏倚。對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),所有文獻(xiàn)沒(méi)有提前進(jìn)行估算試驗(yàn)樣本量,這些試驗(yàn)對(duì)隨機(jī)化的描述有限,多數(shù)研究隨機(jī)分配方案是否隱藏未描述,部分研究未采用盲法,所有研究均無(wú)病例脫落標(biāo)準(zhǔn)與病例剔除標(biāo)準(zhǔn),所納入研究文獻(xiàn)的質(zhì)量不高,結(jié)果有夸大試驗(yàn)組療效的嫌疑,可靠性降低。

參考文獻(xiàn)

[1]MicroRNA-34a and its target genes:Key factors in cancer multidrug resistance.Morteza Ghandadi;;Amirhossein Sahebkar.Current Pharmaceutical Design,2016

[2]Identification and verification of transgelin-2 as a potential biomarker of tumor-derived lung-cancer endothelial cells by comparative proteomics.Hongwei Jin;;Xiao Cheng;;Yihua Pei;;Jianguo Fu;;Zhi Lyu;;Huifang Peng;;Qin Yao;;Yu Jiang;;Lianzhong Luo;;Huiqin Zhuo.Journal of Proteomics,2016

[3]Every Cell Is Special:Genome-wide Studies Add a New Dimension to Single-Cell Biology.Jan Philipp Junker;;Alexander van Oudenaarden.Cell,2014

[4]Cancer biomarker discovery:Current status and future perspectives.Katrin M?bert;;Monica Cojoc;;Claudia Peitzsch;;Ina Kurth;;Serhiy Souchelnytskyi;;Anna Dubrovska.International Journal of Radiation Biology,2014

[5]孫劍峰.扶正抑癌1號(hào)方聯(lián)合吉非替尼治療非小細(xì)胞肺癌的臨床及作用機(jī)制研究[D].成都中醫(yī)藥大學(xué),2019.