背景^[1-3]

人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞建系于1964年。它衍生于子宮內(nèi)膜癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，具有癌細(xì)胞的基本特性，能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生明顯腫瘤。但細(xì)胞的生物學(xué)特性及超微結(jié)構(gòu)尚未深入研究，僅發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系促黑激素合成為陰性。細(xì)胞常用于人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)特性研究。

人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞

人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞培養(yǎng)操作:

1)復(fù)蘇人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3min（視細(xì)胞消化情況而定），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞及人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4][5]

人子宮內(nèi)膜腺癌(轉(zhuǎn)移)細(xì)胞可以用于人子宮內(nèi)膜腺癌來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

分離培養(yǎng)并鑒定子宮內(nèi)膜腺癌組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Endometrial adenocarcinoma derived Mesenchymal Stem Cells,ECMSCs),比較其與正常子宮內(nèi)膜組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Endometrium derived Mesenchymal Stem Cells,EMSCs)的生物學(xué)特性差異,為研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制、侵襲轉(zhuǎn)移及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方法:1.無菌條件下獲取子宮內(nèi)膜腺癌組織,經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后種植于培養(yǎng)瓶中,用含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng),采用組織貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs,0.25%胰酶消化傳代,同時(shí)取正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs做對(duì)照培養(yǎng)。顯微觀察子宮內(nèi)膜腺癌和正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs細(xì)胞形態(tài),瑞氏-姬姆薩染色觀察細(xì)胞核質(zhì),CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型及細(xì)胞周期。誘導(dǎo)MSCs向脂肪、成骨細(xì)胞分化,通過油紅O染色檢測(cè)成脂誘導(dǎo)分化能力,堿性磷酸酶染色及Von Kossa染色檢測(cè)成骨誘導(dǎo)分化能力,并提取總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)相關(guān)成脂成骨轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)量變化。

2. 對(duì)分離鑒定得到子宮內(nèi)膜腺癌及正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)能力的檢測(cè),通過淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(Lymphocyte transformation test,LTT)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(Mixed Lymphocyte Reaction,MLR)檢測(cè)MSCs抑制T細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)能力。并通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩種MSCs的免疫相關(guān)因子IL-6、IL-10、VEGF和TGF-β1的表達(dá)差異性。

結(jié)果:1.從子宮內(nèi)膜腺癌組織中可培養(yǎng)出貼壁生長(zhǎng)的成纖維樣的細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭狀,旋渦狀和放射狀排布,原代生長(zhǎng)緩慢,經(jīng)α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代后生長(zhǎng)迅速,凍存復(fù)蘇后仍保持較強(qiáng)的增殖能力;經(jīng)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,繪制子宮內(nèi)膜腺癌來源MSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,細(xì)胞呈“S”型曲線生長(zhǎng);流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,可見80%左右細(xì)胞分布在G0/G1期,檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞標(biāo)記物,細(xì)胞表達(dá)CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC,不表達(dá)CD14、CD34、CD45、CD31、HLA-DR,提示分離得到的細(xì)胞符合MSCs的干細(xì)胞特征;此分離得到的細(xì)胞可經(jīng)誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞,油紅O染色可見有大量脂滴出現(xiàn),RT-PCR檢測(cè)可見脂肪分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ2的顯著表達(dá);經(jīng)成骨誘導(dǎo)14天,可見堿性磷酸酶染色陽性,誘導(dǎo)28天Von-Kossa染色可見鈣化骨結(jié)節(jié)形成;RT-PCR檢測(cè)可見成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Osteocalcin的表達(dá),說明從子宮內(nèi)膜腺癌組織中成功分離得到MSCs。

3. 對(duì)從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離得到的MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行檢測(cè)。LTT結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs能有效抑制經(jīng)由Con A刺激的T淋巴細(xì)胞增殖,且隨著MSCs數(shù)量的增加,其抑制能力逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);與之相近,MLR結(jié)果證實(shí)MSCs也可抑制異體淋巴細(xì)胞作為抗原刺激T細(xì)胞增殖的過程,且伴隨MSCs用量增加,其抑制作用更顯著。通過RT-PCR檢測(cè)MSCs中各免疫因子表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs中IL-10、VEGF、TGF-β1的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IL-6差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

結(jié)論:1.從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離培養(yǎng)出MSCs,子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs和正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs形態(tài)主要以長(zhǎng)梭形為主,呈旋渦狀生長(zhǎng)排布。

2. 子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs表達(dá)CD73、CD90、CDCD105、CD166、HLA-ABC,不表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR,細(xì)胞周期及細(xì)胞表面標(biāo)記物符合干細(xì)胞特征。

3.子宮內(nèi)膜腺癌組織來源MSCs具有分化成脂肪及成骨細(xì)胞的能力,其成脂分化能力強(qiáng)于正常子宮內(nèi)膜組織來源MSCs,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

參考文獻(xiàn)

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