背景[1]
尿嘧啶DNA糖基化酶 (UDG) 是一種關(guān)鍵的DNA修復(fù)酶, 有助于保持基因組的完整性.UDG特異性移除DNA中的尿嘧啶 (U) 堿基, 產(chǎn)生無(wú)嘌呤/無(wú)嘧啶 (AP) 位點(diǎn)用于下游的修復(fù)過(guò)程.UDG活性的異常能導(dǎo)致修復(fù)過(guò)程紊亂和基因突變, 最終導(dǎo)致相關(guān)疾病, 包括淋巴瘤、布盧姆綜合癥和人類免疫缺陷病.因此, 檢測(cè)UDG活性是一種候選工具用于生物醫(yī)學(xué)研究和疾病預(yù)后.
活性檢測(cè)的常用策略[2]
檢測(cè)UDG活性的常用策略包括凝膠策略、電化學(xué)策略和比色策略.與這些策略相比, 熒光策略由于具有安全、簡(jiǎn)單和靈敏的優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注.檢測(cè)UDG活性的熒光策略一般是基于含多個(gè)U堿基的DNA探針.
當(dāng)UDG移除DNA探針中的多個(gè)U堿基時(shí), DNA探針的構(gòu)型將會(huì)發(fā)生變化, 進(jìn)而將對(duì)目標(biāo)物UDG的識(shí)別事件轉(zhuǎn)換成輸出信號(hào).盡管這些策略已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了良好的性能, 但是仍然存在一些不足影響它們?cè)跈z測(cè)低活性UDG中的應(yīng)用.由于每個(gè)DNA探針中的多個(gè)U堿基不能被低活性的UDG同時(shí)移除, 使得DNA探針的構(gòu)型不能發(fā)生徹底的改變, 從而導(dǎo)致低效率的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).因此, 期望發(fā)展一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高的新型熒光策略用于UDG活性的檢測(cè).
連接酶反應(yīng)是指在連接DNA雙鏈中的單鏈缺口時(shí), DNA連接酶只能在缺口兩側(cè)堿基對(duì)完全匹配時(shí), 才能將其特異性地連接[3].而當(dāng)缺口3’側(cè)存在堿基錯(cuò)配時(shí), 連接酶反應(yīng)將被抑制.這里, 發(fā)展了一種連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的熒光策略用于高效檢測(cè)UDG活性.
首先, 兩條短寡核苷酸鏈分別與發(fā)夾探針環(huán)部序列的一半進(jìn)行雜交, 形成含缺口的DNA復(fù)合物.此時(shí), 這兩條短寡核苷酸鏈的剛性不足以打開(kāi)發(fā)夾探針.
然后, 在UDG的作用下, 發(fā)夾探針環(huán)部的單個(gè)U堿基被移除并產(chǎn)生AP位點(diǎn).其中, AP位點(diǎn)也是一種類型的堿基錯(cuò)配.相應(yīng)地, 位于缺口3’側(cè)的AP位點(diǎn)能抑制連接酶反應(yīng), 使得位于發(fā)夾探針末端的立足點(diǎn)和鏈遷移區(qū)域仍保持彼此鄰近的狀態(tài).隨后, 鄰近的立足點(diǎn)和鏈遷移區(qū)域能夠引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (HCR) 反應(yīng), 產(chǎn)生大量的G四倍體 (G4) 結(jié)構(gòu).
最后, G4結(jié)構(gòu)能與N甲基卟啉IX (NMM) 相互作用, 產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號(hào).當(dāng)UDG不存在時(shí), 連接酶反應(yīng)能將缺口兩側(cè)短寡核苷酸鏈連接成一條剛性增強(qiáng)的長(zhǎng)DNA鏈, 進(jìn)而將發(fā)夾探針打開(kāi), 使得位于發(fā)夾探針末端的立足點(diǎn)和鏈遷移區(qū)域彼此分離, 不能引發(fā)隨后的HCR反應(yīng).本策略對(duì)UDG活性的檢測(cè)限低至0.00020U/mL, 并能將UDG與其它DNA糖基化酶很好地區(qū)分開(kāi)來(lái).此外, 本策略也能用于檢測(cè)HeLa細(xì)胞裂解液中的UDG活性, 并且細(xì)胞中其它組分對(duì)本策略造成的干擾很小.
切除DNA序列中不應(yīng)存在的尿嘧啶[4]
此檢測(cè)方法的原理是利用UDG酶切除雙鏈DNA ON1-ON2中具有尿嘧啶的ON2，釋放出富含G堿基的ON1。隨后，ON1折疊形成G-四鏈體，與盧宇靖課題組合成的高選擇性熒光探針DID-VP結(jié)合，產(chǎn)生熒光。即通過(guò)熒光強(qiáng)度與UDG濃度形成，達(dá)到對(duì)UDG線性檢測(cè)的目的。
參考文獻(xiàn)
[1] 連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的熒光策略用于高效檢測(cè)尿嘧啶-DNA糖基化酶的活性.吳玉姝 吳敏 劉敏.聊城大學(xué)生物制藥研究院 聊城市人民醫(yī)院
[2] Souza-Pinto N C, Harris C C, Bohr V A.p53functions in the incorporation step in DNA base excision repair in mouse liver mitochondria[J].Oncogene, 2004, 23:6559-6568.
[3] Wabuyele M B, Farquar H, Stryjewski W, et al.Approaching real-time molecular diagnostics:single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) detection for the analysis of low abundant point mutations in K-ras oncogenes[J].J Am Chem Soc, 2003, 125:6937-6945.
[4] Sensitive and selective detection of uracil-DNA glycosylase activity with a new pyridinium luminescent switch-on molecular probe.