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  • 熱敏UDG酶的應(yīng)用

    2019/12/31 8:22:47

    背景[1]

    熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是來(lái)源于嗜冷海洋細(xì)菌經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的的重組蛋白,又稱(chēng)南極熱敏UDG。該UDG酶能有效地水解單鏈或雙鏈 DNA 上的尿嘧啶,產(chǎn)生的缺嘧啶位點(diǎn),在高溫或高 pH 下,極易水解斷裂。該酶對(duì)RNA無(wú)活性,主要用于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的防污染。大腸桿菌來(lái)源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶較為耐熱,經(jīng)95℃10min處理仍會(huì)殘留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性,導(dǎo)致含有dU堿基的PCR產(chǎn)物的降解。

    而來(lái)源于嗜冷海洋細(xì)菌的熱敏型UDG在50℃ 5min即完全失活,在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前,在PCR混合液中添加尿嘧啶-DNA 糖基化酶(熱敏性),25℃10min即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染,由于尿嘧啶-DNA 糖基化酶(熱敏性)在PCR循環(huán)的94℃變性一步便可被滅活,因此不會(huì)影響新的含dU的PCR產(chǎn)物。

    應(yīng)用[1]

    尿嘧啶糖基化酶在D P 防污染中的應(yīng)用

    熱敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶可用于去除單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶堿基,也可以去除 PCR 殘存污染。在PCR 操作過(guò)程中,最容易出現(xiàn)污染” 問(wèn)題,原因主要有如下幾種情況:

    ①模板的交叉污染:在樣品采集或處理中,氣溶膠、加樣器取樣時(shí)的泡沫或其他原因引起樣品或模板的交叉污染,造成假陽(yáng)性,屬于正常DNA 由A、T、G、C 四種堿基組成引起的污染;

    ② 擴(kuò)增產(chǎn)物的污染:在擴(kuò)增過(guò)程中,將堿基T 置換成U,使得擴(kuò)增產(chǎn)物為U-DNA (由A、U、G、C四種堿基組成),由于產(chǎn)物量特別大,容易溢漏引起污染,造成假陽(yáng)性;

    ③ 核酸酶、蛋白酶的污染造成假陰性;在這三種情況中最為嚴(yán)重是第二種,即稱(chēng)之為“ 殘留污染” ,因?yàn)镻CR 擴(kuò)增的放大倍數(shù)高達(dá)千萬(wàn)倍,而且在實(shí)際應(yīng)用中擴(kuò)增一直在反復(fù)進(jìn)行,造成擴(kuò)增產(chǎn)物的大量堆積,難于將其控制降解,即使是熒光PCR 也很難避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,為了使得PCR 結(jié)果更加可靠、準(zhǔn)確,有必要在反應(yīng)管完全封閉后于管內(nèi)通過(guò)酶或其他方法,將操作過(guò)程中可能帶人的殘留污染物破壞,使其不能成為新一輪擴(kuò)增的模板,從UDG 的生物學(xué)性質(zhì)可知,它是完成這一任務(wù)的選擇。

    從生物學(xué)特性來(lái)看,UDG 是一種常見(jiàn)的DNA 修復(fù)酶之一,具有DNA 糖苷酶的一般特性—不依賴(lài)鎂離子、球蛋白、分子量小,能夠特異地作用于DNA 分子中的尿嘧啶殘基,不能作用于游離的尿嘧啶核苷、RNA 和四種正常的核苷酸等,在DNA 修復(fù)中起重要作用。

    作用原理[1]

    大腸桿菌熱敏尿嘧啶DNA糖基化酶( UDG 也有些文章簡(jiǎn)寫(xiě)為UNG ) 是PCR 防污染應(yīng)用最廣泛的酶之一,由UNG基因編碼;該基因位于染色體5 分鐘處,全基因長(zhǎng)750bP,含有一個(gè)ORF,其長(zhǎng)度為678b p,編碼229 個(gè)氨基酸,理論蛋白質(zhì)分子量為25,66 4Da;PCR 防污染正是利用了UDG在DNA 修復(fù)過(guò)程中的生物學(xué)特性,下面是UDG 作用于含尿啥吮的DNA ( U-DNA ) 的化學(xué)圖解(圖1) 和P CR 防污染的示意圖(2):

    由圖一可以看出,在適宜的條件下,UDG 能特異地識(shí)別DNA 分子中出現(xiàn)的鳥(niǎo)嘧啶核苷,并將其切割下來(lái),形成自由的尿嘧啶,在DNA 除去尿嘧啶的部位留下“糖一磷酸骨架” 完整的無(wú)堿基“空洞”即脫嘌呤嘧啶位點(diǎn),在加熱或堿性條件下,DNA 在“ 糖一磷酸骨架”處斷裂,這就是UDG 水解含尿嘮吮DNA 的化學(xué)原理。

    在圖二中首先可以看到,由正常堿基A、T、G、C 構(gòu)成的正常DNA,可以通過(guò)PCR 反應(yīng),用dUTP 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的d竹P 擴(kuò)增出大量含有尿嚓吮的DNA ( U-DNA ),是熱敏尿嘧啶-DNA糖基化酶的有效底物;當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物作為“殘留污染物”時(shí),它能通過(guò)UDG 的水解作用產(chǎn)生脫嘧啶嘌呤位點(diǎn),該位點(diǎn)當(dāng)進(jìn)行PCR 預(yù)變性時(shí)DNA 鏈在這些位點(diǎn)發(fā)生斷裂,失去模板的功能,同時(shí),通過(guò)預(yù)變性能夠?qū)⒎磻?yīng)體系中的UDG 滅活,一方面有效的防止了“ 殘留污染物”對(duì)PCR 反應(yīng)帶來(lái)的污染,達(dá)到預(yù)防污染的目的,另一方面又有效地保護(hù)了新生擴(kuò)增產(chǎn)物,完成新的PCR 擴(kuò)增。

    主要參考資料

    [1] 李振勇, 劉明霞. 尿嘧啶 DNA 糖基化酶在 PCR 防污染中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊, 2001, 3(4): 305-306.

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