背景^[1]

高保真PCR酶利用自身的3’→5’外切酶活性（pfu DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase等）能保證PCR產(chǎn)物的保真度，但擴增的PCR產(chǎn)物為不帶A尾的平末端DNA片段，不能直接TA克隆。因此，平末端DNA片段需要進(jìn)行加A后方可TA克隆。平末端DNA加A的步驟一般是先純化PCR產(chǎn)物，加入dATP Buffer利用Taq DNA polymerase在平末端片段后加上A尾后才能與T載體的T頭互補連接TA克隆。步驟較為煩鎖，要購買特定的dATP Buffer。經(jīng)過優(yōu)化后的A-Tailing Enzyme可以有效地將dAMP摻入平末端DNA片段的3′端。3′-dA DNA產(chǎn)物在隨后的連接步驟中可防止相互形成多聚體。

應(yīng)用^[2]

加A尾的DNA連接到具有互補dT突出端的連接子或克隆載體上。

用A-Tailing Enzyme模塊加A尾的DNA可以連接到具有互補dT突出端的連接子或克隆載體上。

方法改進(jìn)：平末端DNA片段加A方法根據(jù)實驗者的技能程度推薦兩種方法：

（1）保守法，先對平末端PCR產(chǎn)物純化后，濃度要求至少20ng/ ul（大概就好，跑膠圖像條帶清晰，明亮），取14.5 ul PCR產(chǎn)物，加入2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在72度反應(yīng)10~20min, 后直接回收純化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作容易，成功率高；

（2）快速法，高保真酶PCR后的管子（體系為50ul）不用先純化直接加入3ul dNTP 和0.5 ul Taq酶繼續(xù)72度反應(yīng)10~20min，此后直接回收或跑膠回收純化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作步驟較少和方便，節(jié)省實驗時間和實驗經(jīng)費。

結(jié)果：推薦的兩種方法均能使平末端DNA片段加A尾，方便TA克隆。另外，使用dNTP 代替dATP，節(jié)省實驗經(jīng)費。

參考文獻(xiàn)

[1] 末端加A酶產(chǎn)品介紹

[2]生物通