背景^[1-3]

VAMP2抗體是一種可以特異性結(jié)合VAMP2的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的VAMP2蛋白。VAMP2抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

VAMP2，即囊泡相關(guān)膜蛋白2，別名synaptobrevin-2。它是一種在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，主要在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)。VAMP2作為可溶性細(xì)胞膜的關(guān)鍵成分之一，參與形成SNARE（可溶性細(xì)胞膜因子附著蛋白受體）復(fù)合體，與syntaxin-1A和SNAP-25結(jié)合產(chǎn)生誘導(dǎo)融合孔形成的力量，從而介導(dǎo)突觸小泡的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。VAMP2在生物學(xué)上的意義非常重大，它不僅參與神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放，影響神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞，還與多種神經(jīng)退行性疾病和精神疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。VAMP2的活性受到多種因素的精細(xì)調(diào)控，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝離子等。研究表明，VAMP2在不同區(qū)域的突觸小泡膜上展現(xiàn)出不同的構(gòu)象，膽固醇豐富的微域?qū)ζ錁?gòu)象和SNARE組裝有重要影響。此外，VAMP2的膜結(jié)合特性和活性狀態(tài)在突觸前細(xì)胞質(zhì)中受到嚴(yán)格調(diào)控，這對(duì)于神經(jīng)遞質(zhì)釋放的時(shí)空精度至關(guān)重要。

VAMP2抗體

VAMP2抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開(kāi)電源，電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠，即可打開(kāi)玻璃板；取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說(shuō)明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽(yáng)極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng)，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時(shí)。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1）將膜和一抗（VAMP2抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(VAMP2抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

VAMP2抗體可以用于Rab10 Thr73位點(diǎn)磷酸化在腦內(nèi)的生理作用研究

研究目的:1.探討Rab10 Thr73位點(diǎn)磷酸化對(duì)小鼠行為學(xué)表型的影響;2.探討Rab10 Thr73位點(diǎn)磷酸化影響的主要腦區(qū)和細(xì)胞類型;3.探討Rab10 Thr73位點(diǎn)磷酸化對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)、功能的影響及其分子機(jī)制。

研究方法:1.構(gòu)建模擬Rab10持續(xù)非磷酸化和持續(xù)磷酸化狀態(tài)的小鼠模型利用CRISPR/Cas9技術(shù),分別構(gòu)建模擬Rab10持續(xù)非磷酸化狀態(tài)和持續(xù)磷酸化狀態(tài)的Rab10 T73V和T73D突變小鼠模型,并利用DNA測(cè)序、免疫蛋白印跡(Western Blot,WB)對(duì)Rab10的突變和表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.檢測(cè)Rab10突變小鼠的行為學(xué)表型對(duì)3月齡Rab10T73V/T73V小鼠和3月齡、5月齡、7月齡和9月齡Rab10T73D/+小鼠及同窩Rab10+/+小鼠進(jìn)行一系列的行為學(xué)檢測(cè),包括:曠場(chǎng)試驗(yàn)、高架十字迷宮試驗(yàn)、明暗箱試驗(yàn)、Y迷宮試驗(yàn)、○迷宮試驗(yàn)、T迷宮試驗(yàn)、藏寶試驗(yàn)、筑巢試驗(yàn)、巴恩斯迷宮、加速旋轉(zhuǎn)桿試驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)、條件性恐懼試驗(yàn)、代謝籠和新物體識(shí)別試驗(yàn),用以檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)度、焦慮樣行為、重復(fù)性強(qiáng)迫樣行為、學(xué)習(xí)記憶、抑郁樣行為、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和能量代謝等方面的表型。

3.檢測(cè)Rab10突變小鼠突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變提取Rab10+/+及Rab10T73V/T73V小鼠紋狀體、杏仁核、背側(cè)海馬、腹側(cè)海馬和前額葉皮層這5個(gè)與焦慮行為相關(guān)的腦區(qū)蛋白,VAMP2抗體WB檢測(cè)VAMP1、VAMP2、Syntaxin 1、SHANK2、Synaptophysin、PSD95等突觸蛋白的表達(dá)水平,確定Rab10 T73V突變影響的主要腦區(qū)。再對(duì)實(shí)驗(yàn)中確定的責(zé)任腦區(qū)——紋狀體進(jìn)行針對(duì)性檢測(cè):利用腦片膜片鉗,記錄中型棘突神經(jīng)元(medium spiny neuron,MSN)微小抑制性突觸后電流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)和微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC),以檢測(cè)突觸功能;利用透射電鏡觀察突觸密度、突觸小泡的密度和直徑、突觸后致密斑的長(zhǎng)度和寬度;對(duì)紋狀體腦區(qū)進(jìn)行抑制性突觸前、后標(biāo)志物GAD67和Gephyrin,興奮性突觸前、后標(biāo)志物VGLUT1和PSD95的免疫熒光染色,分析抑制性突觸和興奮性突觸的密度。

參考文獻(xiàn)

[1]Differential contributions of ventral striatum subregions to the motivational and hedonic components of the affective processing of reward.[J].Pool Eva R;Munoz Tord David;Delplanque Sylvain;Stussi Yoann;Cereghetti Donato;Vuilleumier Patrik;Sander David.The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience.2022

[2]The Regulation of Rab GTPases by Phosphorylation[J].Xu Lejia;Nagai Yuki;Kajihara Yotaro;Ito Genta;Tomita Taisuke.Biomolecules.2021

[3]Dorsolateral Striatal Task initiation Bursts Represent Past Experiences More than Future Action Plans.[J].Cunningham Paul J;Regier Paul S;Redish A David.The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience.2021

[4]Defective insulin-stimulated GLUT4 translocation in brown adipocytes induces systemic glucose homeostasis dysregulation independent of thermogenesis in female mice.[J].Picatoste Belén;Yammine Lucie;Leahey Rosemary A;Soares David;Johnson Emma F;Cohen Paul;McGraw Timothy E.Molecular metabolism.2021

[5]張菁.Rab10 Thr73位點(diǎn)磷酸化在腦內(nèi)的生理作用研究[D].山東大學(xué),2023.