背景^[1-3]

XL1-BLUE感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌XL1-Blue菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107，－70℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。XL1-Blue菌株能保證高拷貝質(zhì)粒穩(wěn)定復(fù)制，recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。hsdR17突變導(dǎo)致EcoK核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)缺失，增強(qiáng)了外源DNA的穩(wěn)定性和提取質(zhì)量。lacIqZΔM15的存在使XL1-Blue菌株可用于藍(lán)、白斑篩選。

 XL1-BLUE感受態(tài)細(xì)胞

XL1-BLUE感受態(tài)細(xì)胞基因型：

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44(rk-,mk+),relA1 lac[F'proAB lacIqZ?M15:Tn10(TetR)]

XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞能夠利用藍(lán)白斑篩選進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定，是使用質(zhì)?；騆ambda載體進(jìn)行常規(guī)克隆的優(yōu)良的克隆菌株。

XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞是核酸內(nèi)切酶缺陷型（end A）宿主菌，這能夠有效提升小提質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。

XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞是重組缺陷型宿主菌（rec A），能夠有效提升插入片段的穩(wěn)定性。細(xì)胞內(nèi)的hsdR基因突變，能夠阻止克隆的DNA被EcoK核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)的酶切。

XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞中的F’附加體上面的lacIqZΔM15基因使得改宿主菌能夠應(yīng)用藍(lán)白斑篩選進(jìn)行克隆質(zhì)粒的鑒定。

操作方法：

1.XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA(質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于PDCoV豬源噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及抗N蛋白單鏈抗體的篩選研究

利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了豬源噬菌體單鏈抗體庫,通過四輪篩選獲得了能與PDCoVN蛋白特異性結(jié)合的噬菌體scFv,并對篩選到的scFv進(jìn)行了真核表達(dá),對其活性進(jìn)行了驗(yàn)證,以期為該病毒的免疫檢測和防治奠定一定的基礎(chǔ)。

具體研究內(nèi)容如下:1.PDCoV豬源噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建從感染PDCoV的豬脾臟中提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以此為模板擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因,并利用重疊延伸PCR將其拼接為scFv基因。將scFv基因克隆至噬菌粒質(zhì)粒pSEX81后,電轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建豬源單鏈抗體基因文庫。經(jīng)測算,VH-VLκ累積庫容約為6.5×107cfu/mL,VH-VLλ累積庫容約為1.7×108 cfu/mL,經(jīng)PCR鑒定插入基因片段大小的正確率約為80%。使用輔助噬菌體M13K07侵染初級基因文庫,構(gòu)建噬菌體單鏈抗體初級庫,滴度為4.5×109 pfu/mL。

2. 抗PDCoV N蛋白單鏈抗體的富集與篩選為了得到針對PDCoVN蛋白的特異性scFv,以原核表達(dá)的N蛋白為靶蛋白包被ELISA板,采用微孔板篩選法對抗體庫進(jìn)行4輪富集篩選以富集特異性噬菌體抗體,最終抗體庫的富集倍數(shù)約為310倍。從第四輪篩選的平板上隨機(jī)挑取84個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定,其中陽性克隆為1 1個(gè),經(jīng)測序及序列比對分析,符合抗體可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)且無終止密碼子的共有5個(gè),最終經(jīng)phage-ELISA驗(yàn)證得到3株親和力較高的噬菌體抗體,分別為scFv-25、scFv-27和scFv-53。

3.特異性單鏈抗體的表達(dá)和活性檢測為了得到有活性的scFv,將篩選得到的scFv基因克隆到真核表達(dá)載體pFUSE-hIgG-Fc2上,經(jīng)測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá),最終成功表達(dá)兩個(gè)scFv,并利用Protein A對其進(jìn)行純化。ELISA結(jié)果顯示兩株抗體都能與PDCoV反應(yīng)而不與其他豬常見病毒反應(yīng),表明抗體特異性良好;Western blot結(jié)果顯示所表達(dá)抗體可以與PDCoV反應(yīng);間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）顯示兩株抗體都能特異性識別PDCoV。

參考文獻(xiàn)

[1]Susceptibility of Chickens to Porcine Deltacoronavirus Infection[J].Qingqing Liang,Honglei Zhang,Bingxiao Li,Qingwen Ding,Yabin Wang,Wenming Gao,Donghui Guo,Zhanyong Wei,Hui Hu.Viruses.2019(6)

[2]High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans.[J].Ramy Arnaout,William Lee,Patrick Cahill,Tracey Honan,Todd Sparrow,Michael Weiand,Chad Nusbaum,Klaus Rajewsky,Sergei B Koralov.PLoS ONE.2017(8)

[3]Cryo-EM structure of porcine delta coronavirus spike protein in the pre-fusion state[J].Shang Jian,Zheng Yuan,Yang Yang,Liu Chang,Geng Qibin,Tai Wanbo,Du Lanying,Zhou Yusen,Zhang Wei,Li Fang.Journal of Virology.2017(4)

[4]Calves are susceptible to infection with the newly emerged porcine deltacoronavirus,but not with the swine enteric alphacoronavirus,porcine epidemic diarrhea virus.[J].Jung Kwonil,Hu Hui,Saif Linda J.Archives of virology.2017(8)

[5]張藝璇.PDCoV豬源噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及抗N蛋白單鏈抗體的篩選[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2021.