背景^[1-3]

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒采用可以高效、專一結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，既適用于革蘭氏陰性菌基因組DNA的提取，也可適用于革蘭氏陽性菌基因組DNA的提取。本試劑盒也可用于食品致病菌(微生物)基因組提取，如：金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、出血性大腸桿菌O157：H7、單增李斯特、沙門氏菌、阪崎腸肝菌等?？蓮?-5 ml細(xì)菌培養(yǎng)液中，快速提取純化10-40μg純凈的基因組DNA，所得基因組DNA可直接用作PCR模板、酶切、雜交等分子生物學(xué)實驗。

細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒

提取步驟:

1、取細(xì)菌培養(yǎng)物1-5ml(106-108個細(xì)胞,最多不超過2×109個細(xì)胞)置于離心管(自備)中,12000rpm(~~13400×g)離心1分鐘,盡量吸凈上清。

2、向沉淀中加入180μl Buffer GTL,振蕩使菌體重懸。

3、加入20μl蛋白酶K,渦旋混勻,56℃孵育,直至溶液變清亮,孵育過程中每隔一段時間顛倒或震蕩離心管使樣本分散。

4、加入200μl Buffer GL,渦旋震蕩充分混勻。加200μl無水乙醇,渦旋震蕩充分混勻。短暫離心,使管壁上的溶液收集到管底。

5、將步驟4所得溶液(包括形成的沉淀)全部加入到已裝入收集管的吸附柱中,若一次不能加完溶液,可分多次轉(zhuǎn)入。12000rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇),12000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。

注意:如需進(jìn)一步提高DNA純度,可重復(fù)步驟7。

8、12000rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,以徹底晾干。

9、將吸附柱置于一個新的離心管中,向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μl Buffer GE,室溫放置2-5分鐘,12000rpm離心1分鐘,收集DNA溶液,-20℃保存DNA。

應(yīng)用^[4][5]

用于水稻白葉枯病菌致病性功能基因組學(xué)分析研究

革蘭氏陰性菌水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的白葉枯病是水稻（Oryza sativa L.）生產(chǎn)上最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害,它也是研究植物——病原互作的重要模式菌。為研究Xoo致病分子機(jī)制,開展致病基因功能基因組學(xué)分析,我們用近年來廣為使用的“鳥槍法”（shotgun）測序策略對PR6菌株基因組全序列進(jìn)行測定。

構(gòu)建三套高質(zhì)量基因組文庫,用小片段文庫進(jìn)行大規(guī)模序列測定。迄今己完成21211 reads測序工作,測序總長度達(dá)16459736 bp,約3.3倍基因組序列覆蓋率。序列經(jīng)初步組裝獲得529個Contigs,長度達(dá)4.94 Mb,得到了PR6菌株基因組全序列基本框架。組裝序列分析發(fā)現(xiàn),框架序列中能找到4555個（98.23%）編碼蛋白基因序列與Xoo KACC 10331菌株序列高度同源。

這為進(jìn)一步確定和分離Xoo致病基因及其功能基因組學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)。通過致病性分析,從17184個Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫中篩選到在水稻感病品種IR24上致病性明顯下降或完全喪失的突變體332個。對其中的112個突變體Southern blot分析表明,有105個突變體（93.76%）的轉(zhuǎn)座子在基因組上為單拷貝插入。在PSA培養(yǎng)基上,大多數(shù)致病性相關(guān)突變體的培養(yǎng)特征與野生型相同,能正常分泌胞外酶。通過TAIL-PCR分離的轉(zhuǎn)座子側(cè)翼片斷屬于46個基因,還有14個突變體的插入位點位于內(nèi)源轉(zhuǎn)座子或啟動子上或基因間。

41個已經(jīng)確定功能的基因中與分泌系統(tǒng)有關(guān)的超過三分之一（15個）,說明分泌系統(tǒng)對致病性有重要作用。其它主要是一些與胞外多糖、脂多糖合成有關(guān)及與細(xì)菌基礎(chǔ)代謝和基因調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。有15個突變體的轉(zhuǎn)座子插入位點分別位于Ⅱ型分泌系統(tǒng)xps基因簇的6個基因上,PCR、Southern blot證實突變體確為轉(zhuǎn)座子插入引起。突變體生長培養(yǎng)特征、胞外多糖分泌與野生型無明顯差異,但胞外酶不能有效分泌。

通過測序和PCR方法得到11037 bp的xps基因簇全長序列,并克隆了其中的6個xps基因;序列同源性分析發(fā)現(xiàn),PR6菌株的xps基因簇與其它病原黃單胞菌小種的序列同源性很高。初步的xps基因簇的SDS-PAGE、RT-PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn),xps基因除共同啟動子外,基因內(nèi)可能還存在一些各自的啟動子;突變體中至少有兩種蛋白在胞間周質(zhì)累積,其中有一種蛋白可能編碼木聚糖酶。在112個致病性相關(guān)突變體中,發(fā)現(xiàn)有一轉(zhuǎn)座子插入到編碼芳香族氨基酸代謝途徑DAHP合成酶基因（aroG基因）上的突變株。

參考文獻(xiàn)

[1]Lipopolysaccharide biosynthesis in Xanthomonas campestris pv.campestris:a cluster of 15 genes is involved in the biosynthesis of the LPS O-antigen and the LPS core[J].F.-J.Vorh?lter,K.Niehaus,A.Pühler.Molecular Genetics and Genomics.2001(1)

[2]Xanthomonas campestris pv.campestris secretes the endoglucanases ENGXCA and ENGXCB:construction of an endoglucanase-deficient mutant for industrial xanthan production[J].K.Schr?ter,E.Flaschel,A.Pühler,A.Becker.Applied Microbiology and Biotechnology.2001(6)

[3]The lipopolysaccharides of the phytopathogen Xanthomonas campestris pv.campestris induce an oxidative burst reaction in cell cultures of Nicotiana tabacum[J].Andreas Meyer,Alfred Pühler,Karsten Niehaus.Planta.2001(2)

[4]Transposome Insertional Mutagenesis and Direct Sequencing of Microbial Genomes[J].Les M.Hoffman,Jerry J.Jendrisak,Ronald J.Meis,Igor Y.Goryshin,William S.Reznikoff.Genetica.2000(1)

[5]黃貴修.水稻白葉枯病菌致病性功能基因組學(xué)分析[D].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.