背景^[1-3]

糞便基因組DNA快速提取試劑盒適用于從糞便樣本中提取總DNA，包括細胞、細菌、寄生蟲以及病毒DNA，也適用于含有高濃度PCR反應(yīng)抑制劑的樣本。本品可處理多至300 mg的糞便樣本，純化獲得主要為20-30 kb的DNA片段，純化過程中不需苯酚或氯仿等有毒溶劑，無需乙醇沉淀，可在一小時內(nèi)獲得高純度的DNA。

本試劑盒采用獨特的緩沖系統(tǒng)使裂解液中的DNA高效結(jié)合到吸附柱上，同時糞便中的蛋白雜質(zhì)及抑制下游反應(yīng)的其他有機化合物可流過膜，PCR和酶反應(yīng)的抑制劑以及殘留的雜質(zhì)可通過兩步洗滌步驟有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可獲得高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫構(gòu)建、Southern Blot、分子標記等下游實驗。

糞便基因組DNA快速提取試劑盒

操作步驟：

1.準備工作:取TE buffer,加至蛋白酶K中,充分混勻,配制成20mg/ml的白酶K溶液,可分裝成小份,20保存1年有效。

2.取菌液置于EP管中,離心,棄上清液。再次加入1.5m菌液,重復(fù)該步驟一次。

3.加入Eco裂解液和3μl白酶K溶液(20mg/ml),充分混勻,37℃孵育1h。

4.加入CTAB沉淀液,充分混勻,65℃孵育10min

5.加入780蛋白清除液,充分混勻,12000g離心5~10min

6.轉(zhuǎn)移上清至新EP管中,加入2倍體積的Eco漂洗液,混勻,20℃放置30min或過夜。

7.13000g離心10min,棄上清液,加入70%乙醇洗滌沉淀

8.13000g離心10min,棄上清液,室溫干燥DNA沉淀,加入100或適量TE buffer溶解沉淀,20℃保存。TE buffer體積越大,DNA濃度越低。

應(yīng)用^[4][5]

用于基于LFD-RPA的主要腸道血吸蟲核酸快速可視化檢測方法的建立及初步評價研究

結(jié)合側(cè)流層析試紙條（Lateral flow dipstick,LFD）和重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能簡單、快速識別日本血吸蟲、曼氏血吸蟲核酸的可視化檢測技術(shù),初步評價其對血吸蟲中間宿主或終宿主感染早期的檢測價值,并通過試劑、時間的折算,分析成本投入情況。

方法:以日本血吸蟲SjR2和SjG55A作為靶基因,結(jié)合Primer Premier 5軟件及手工輔助設(shè)計引物,通過簡易檢出限、特異性確定引物序列,初步建立RPA檢測方法。以RPA檢測為基礎(chǔ),設(shè)計探針,確定反應(yīng)條件,初步建立LFD-RPA檢測方法。以PCR方法為平行對照,評價建立檢測方法的最低檢出限、敏感性、特異性及不同終止方式檢測結(jié)果。

制備不同比例混合的陽性釘螺和陰性釘螺基因組,評價LFD-RPA方法的最低檢出混合度。分別取毛蚴感染后不同時期釘螺樣本,用解剖鏡檢法判斷釘螺感染情況,提取釘螺樣本DNA,評價LFD-RPA方法對釘螺不同感染階段的血吸蟲核酸檢測能力,進行RPA、PCR的平行檢測。

LFD-RPA方法檢測現(xiàn)場采集的釘螺樣本,RPA、PCR為平行對照,評價LFD-RPA方法的檢測效果。以曼氏血吸蟲SmCOX1為靶基因,結(jié)合Primer Premier 5軟件、手工輔助設(shè)計篩選引物,確定最終引物序列,初步建立RPA檢測方法。以RPA檢測為基礎(chǔ),設(shè)計探針,確定反應(yīng)條件,初步建立LFD-RPA檢測方法。

以文獻中針對曼氏血吸蟲Sm1-7基因設(shè)計的引物為基礎(chǔ),設(shè)計特異性探針,探索反應(yīng)溫度及時間,建立LFD-RPA檢測方法。以PCR為平行對照,評價建立方法的最低檢出限及與特異性。建立40尾、80尾曼氏血吸蟲尾蚴梯度感染小鼠的動物模型（簡稱“40尾組”、“80尾組”）,并于感染后不同時間收集小鼠糞便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法進行平行檢測,全面評價LFD-RPA方法檢測曼氏血吸蟲早期感染的效能。

隨后,收集本實驗室常用的血吸蟲核酸檢測生物學技術(shù)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),包括需要的試劑盒或主要試劑的具體名稱、單盒價格、單盒反應(yīng)次數(shù)以及來源。計算不同檢測方法的每個樣本投入成本,包括每個樣本檢測所需的試劑成本、勞動力成本。以每個樣本投入試劑成本、勞動力成本為基礎(chǔ),在設(shè)置陰參、陽參的單個樣本檢測情況下,計算每次檢測投入試劑成本、勞動力成本。同時,將96個反應(yīng)作為不同檢測方法批量檢測總量。

計算批量檢測情況下,每個樣本檢測投入試劑成本、勞動力成本。并按照實驗所需儀器數(shù)量將每種方法的技術(shù)要求劃分為簡單、一般、復(fù)雜、極復(fù)雜四個等級,對LFD-RPA和其他核酸檢測方法的成本和技術(shù)要求進行比較分析。

結(jié)果:成功建立了以日本血吸蟲SjR2、SjG55A為靶基因的LFD-RPA檢測方法以及以曼氏血吸蟲SmCOX1、Sm1-7為靶基因的LFD-RPA檢測方法,各方法的反應(yīng)參數(shù)均為39℃、20min。冰上靜置、滴加DNA提取液或酚氯仿三種終止LFD-RPA反應(yīng)的方式對檢測結(jié)果無影響。

以SjR2、SjG55A為靶基因建立的LFD-RPA方法對含有日本血吸蟲靶基因的質(zhì)粒和成蟲基因組最低檢出限分別為1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,優(yōu)于對應(yīng)RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法與曼氏血吸蟲、陽性雙臍螺、埃及血吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲基因組DNA均無交叉反應(yīng)。

SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲基因組DNA無交叉反應(yīng),但可檢出曼氏血吸蟲、陽性雙臍螺,提示與曼氏血吸蟲有交叉反應(yīng)。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分別能最低檢出2000只、1500只陰性釘螺中的1只陽性釘螺,最低檢出混合度均高于對應(yīng)RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可檢出20組1:50的混合陽性釘螺,3中方法的敏感性均為100%。

參考文獻

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[2]Potential Impact of Climate Change on Schistosomiasis:A Global Assessment Attempt.[J].Yang Guo-Jing,Bergquist Robert.Tropical medicine and infectious disease.2018(4)

[3]Point-of-Care Periodontitis Testing:Biomarkers,Current Technologies,and Perspectives[J].Wanghong He,Minli You,Wanting Wan,Feng Xu,Fei Li,Ang Li.Trends in Biotechnology.2018

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[5]王麗萍.基于LFD-RPA的主要腸道血吸蟲核酸快速可視化檢測方法的建立及初步評價[D].中國疾病預(yù)防控制中心,2021.