背景^[1-3]

HUH-7細胞專用培養(yǎng)基可保持HuH-7細胞的生長狀態(tài)。本產(chǎn)品中已包含HuH-7細胞生長所需的各種成分，無需添加任何成分，可直接用于HuH-7細胞的體外培養(yǎng)。HuH-7細胞分離自人肝癌組織可產(chǎn)甲胎蛋白、胰酶α抗體、血漿銅藍蛋白、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白等。

HUH-7細胞專用培養(yǎng)基

培養(yǎng)步驟

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3、輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4、按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于STYK1/NOK對HepG2及Huh-7細胞凋亡、增殖及細胞周期的影響研究

研究STYK1/NOK基因在肝癌細胞系HepG2（肝母細胞瘤來源）和Huh-7（肝細胞肝癌來源）中的作用并明確其作用機制。探討過表達STYK1/NOK對HepG2細胞凋亡、細胞增殖的影響,反向驗證,抑制STYK1/NOK蛋白表達對HepG2細胞凋亡、增殖及細胞周期的影響。隨后,在Huh-7細胞中驗證,明確STYK1/NOK對肝癌細胞系細胞增殖的影響,以期揭悉STYK1/NOK影響肝癌細胞增殖的具體作用機制。

方法:在HepG2細胞中過表達STYK1/NOK,通過western blotting檢測蛋白表達情況,確定STYK1/NOK過表達。使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測分別轉(zhuǎn)染0,2,6μg STYK1/NOK質(zhì)粒的HepG2細胞的凋亡情況,每組重復3組,根據(jù)檢測結(jié)果制作柱形圖。

轉(zhuǎn)染0,2,6μg STYK1/NOK質(zhì)粒,48小時后,應(yīng)用CCK8細胞增殖實驗檢測過表達STYK1/NOK對HepG2細胞增殖的影響,每組重復三組,隨后應(yīng)用OD值制作柱形圖。為了明確檢測結(jié)果,應(yīng)用siRNA抑制HepG2細胞STYK1/NOK蛋白表達后行細胞增殖、細胞凋亡及細胞周期實驗,并采用western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase 3,cleaved-caspase3及凋亡周期蛋白CDC25A,CDK2蛋白的表達情況,明確STYK1/NOK對HepG2細胞凋亡及細胞周期的影響。

并進一步明確具體作用機制。隨后,相關(guān)實驗在另一株肝癌細胞系Huh-7細胞中進行驗證。過表達STYK1/NOK及通過應(yīng)用siRNA抑制Huh-7細胞STYK1/NOK蛋白表達后,行細胞凋亡實驗,并應(yīng)用western bloting檢測抑制STYK1/NOK細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase 3及cleaved-caspase 3的表達情況,再進一步檢測抑制STYK1/NOK蛋白表達后的細胞周期分布情況。

結(jié)果:在轉(zhuǎn)染48h后,收集細胞,提取蛋白,行western blotting檢測,檢測結(jié)果表明STYK1/NOK的表達與轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒濃度相關(guān),呈劑量依賴效應(yīng)。使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測過表達后HepG2細胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染0,2,6μg STYK1/NOK質(zhì)粒組,細胞凋亡百分比逐漸減少,分別為21.1%,19.7%,16.3%,重復三組,應(yīng)用t檢驗統(tǒng)計,具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,表明轉(zhuǎn)染STYK1/NOK抑制了HepG2細胞的凋亡。應(yīng)用CCK8細胞增殖實驗進行檢測,研究過表達STYK1/NOK基因?qū)毎鲋档挠绊憽?/p>

在轉(zhuǎn)染48 h后,加入CCK8試劑,2 h后進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達STYK1/NOK促進HepG2細胞增殖。為了進一步驗證實驗結(jié)果,應(yīng)用siRNA抑制HepG2細胞STYK1/NOK蛋白表達,再次行細胞凋亡實驗,實驗結(jié)果表明抑制STYK1/NOK蛋白表達促進細胞凋亡,分別轉(zhuǎn)染0,2,6μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒,凋亡率分別為30.2%,30.6%,36.5%。

每組重復三組,行t檢驗,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染0μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染6μg si-STYK1/NOK質(zhì)粒組凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。細胞增殖實驗結(jié)果表明,抑制STYK1/NOK抑制HepG2細胞增殖（P<0.01）。Western blotting結(jié)果表明抑制STYK1/NOK蛋白表達后,caspase 3蛋白表達減少,cleaved-caspase 3蛋白表達增加,表明抑制STYK1/NOK裂解活化了caspase3,促進HepG2細胞凋亡。

細胞周期結(jié)果表明,抑制STYK1/NOK蛋白表達后,S期細胞增多,G0/G1、G2/M期細胞減少,Western blotting結(jié)果表明抑制STYK1/NOK蛋白表達后,CDC25A蛋白和CDK2蛋白表達下調(diào),表明抑制STYK1/NOK將HepG2細胞阻滯在S期,從而抑制細胞增殖。隨后,檢測結(jié)果在Huh-7細胞中進行驗證,細胞凋亡實驗、細胞周期實驗結(jié)果均與HepG2結(jié)果相符。抑制Huh-7細胞STYK1/NOK蛋白表達后,通過裂解活化caspase 3促進細胞凋亡。

參考文獻

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