前言
麥角硫因(ergothioneine,EGT)又名為2-硫基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是存在于很多動(dòng)植物體內(nèi)含量豐富的天然氨基酸，僅在部分微生物(放線菌、鏈霉菌)、蕈菌、某些藍(lán)細(xì)菌中合成，不能由動(dòng)物機(jī)體自身合成EGT，人體只能從食物中攝入并通過高特異性的有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1型(organic cation transpoter novel type-1,OCTN1)在各種細(xì)胞和組織中積累高濃度EGT。EGT被認(rèn)為是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，Servillo等對(duì)其抗氧化機(jī)理進(jìn)行了探討，認(rèn)為其擁有獨(dú)特的氧化還原機(jī)制，并提出了一種EGT在細(xì)胞中的獨(dú)特抗氧化作用。EGT的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位是-0.06V，其它硫醇的電勢(shì)一般在-0.32V～-0.2V之間，因此EGT在生理pH環(huán)境下比其他抗氧化劑更穩(wěn)定，不易自發(fā)氧化。研究表明，EGT具有多種重要的生理功能，如抗炎作用；通過保護(hù)DNA實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞保護(hù)功能；通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化作用促進(jìn)神經(jīng)新生達(dá)到的抗抑郁功能；通過抵抗氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的眼睛保護(hù)功能；通過中斷與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生相關(guān)的黏附分子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的心腦血管保護(hù)功能；通過抑制毒性達(dá)到的對(duì)神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療作用等，且本身具有安全性，因此，EGT在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。
EGT生產(chǎn)方式有化學(xué)合成、食用菌提取及微生物發(fā)酵等，由于前兩者成本較高，工序復(fù)雜，因此食用菌菌絲的深層發(fā)酵是目前EGT工業(yè)化生產(chǎn)的主流模式，但自然菌株EGT產(chǎn)量低，需要通過育種技術(shù)培育EGT高產(chǎn)工業(yè)化菌種，培育工業(yè)食用菌菌種的方法有誘變育種、雜交育種、基因工程育種及原生質(zhì)體融合育種等，但每種育種方法都需要進(jìn)行多次、大樣本量EGT含量檢測(cè)，需說明的是，育種過程中EGT含量檢測(cè)的意義更多在于比較樣本間含量高低。目前EGT的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和薄層電泳法等。使用最為廣泛的是高效液相色譜法，該方法可以從物質(zhì)復(fù)雜的體系中準(zhǔn)確檢測(cè)出EGT的含量，但高效液相色譜法有其明顯缺陷，即需探索針對(duì)不同樣品不同的檢測(cè)條件，且由于EGT出峰時(shí)間晚，標(biāo)品昂貴，在育種需從大量樣本中篩選出高產(chǎn)樣本的情況下會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)耗時(shí)過長(zhǎng)，成本過高，極大地阻礙了EGT的開發(fā)與應(yīng)用研究，因此，急需建立一 種可準(zhǔn)確測(cè)定樣本間EGT濃度的高通量快速檢測(cè)方法。
由于EGT具有強(qiáng)抗氧化性，2價(jià)鐵離子還原性適中(既不會(huì)受空氣中氧氣接觸干擾，也不會(huì)因?yàn)檫€原性太弱導(dǎo)致指示性降低)，EGT能與2價(jià)鐵離子反應(yīng)生成無色螯合物，同時(shí)硫氰酸根離子與二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物，根據(jù)以上特點(diǎn)，本研究選用硫氰酸鐵為還原劑，使用麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)品與硫氰酸鐵反應(yīng)，旨在建立一種麥角硫因的高通量檢測(cè)體系。同時(shí)以不同靈芝菌株EGT產(chǎn)量不同對(duì)該高通量檢測(cè)體系進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果將為高產(chǎn)EGT微生物的篩選及高產(chǎn)EGT新菌株的選育提供了新的方法和思路。
代表性結(jié)果
討論與結(jié)論
根據(jù)麥角硫因具有強(qiáng)還原性的理化性質(zhì)，在構(gòu)建出EGT-硫氰酸鐵體系之前，還先后實(shí)驗(yàn)構(gòu)建堿性高錳酸鉀體系、溴甲酚綠體系、藍(lán)瓶子亞甲基藍(lán)體系、愈創(chuàng)木酚體系、氯化鐵-EGT體系，結(jié)果表明：堿性高錳酸鉀體系因?yàn)榉€(wěn)定性低失??；溴甲酚綠體系顯色結(jié)果因?yàn)榕cpH有關(guān)失敗；藍(lán)瓶子亞甲基藍(lán)體系中，由于還原態(tài)亞甲基藍(lán)的還原性太強(qiáng)，與空氣中的氧氣接觸也極易被氧化成亞甲基藍(lán)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無現(xiàn)象而失??；愈創(chuàng)木酚體系同樣因?yàn)檫€原性太強(qiáng)受氧氣接觸干擾而失??；氯化鐵體系因?yàn)轱@色程度太低而失敗。EGT-硫氰酸鐵體系可以用于EGT高通量檢測(cè)方法的研究。
EGT-硫氰酸鐵檢測(cè)體系構(gòu)建過程中發(fā)現(xiàn)，待測(cè)樣品按照普通EGT粗提方法即醇沉-氮吹-定容提取時(shí)，提取液中殘留的酚類物質(zhì)會(huì)影響體系的顯色反應(yīng)，降低體系的靈敏度，因此粗提液在氮吹定容后，需增加氯仿除酚步驟。
靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)名貴的藥用真菌，含有多種生物活性物質(zhì)和生理功能，其麥角硫因含量在眾多食用菌中含量較高，但是作為商業(yè)化生產(chǎn)的菌株其產(chǎn)量還偏低，因此培育高產(chǎn)麥角硫因的靈芝新菌株具有重要的意義及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，基于以上原因，本實(shí)驗(yàn)室通過原生質(zhì)體融合再生，分離鑒定得到一批擬融合子，本方法驗(yàn)證過程使用的靈芝融合子，均來源于此。
本研究建立的方法基于EGT本身理化性質(zhì)，檢測(cè)體系靈敏穩(wěn)定，適用于產(chǎn)EGT工業(yè)發(fā)酵菌株選育過程中，大批量樣本的快速比較，且理論上只需經(jīng)過簡(jiǎn)單的樣品EGT提取優(yōu)化，即可適用于絕大部分菌株EGT含量的高通量快速檢測(cè)，打破了原有EGT研究檢測(cè)的局限性，為EGT的整體開發(fā)應(yīng)用研究提供了新的方法和思路。該研究成果發(fā)表在《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2022年第1期，歡迎引用(點(diǎn)擊左下方“閱讀原文”可查看全文)。
引用格式：
徐晴元,游俊健,林俊芳,等.靈芝麥角硫因高通量檢測(cè)方法研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2022,34:114-120. Xu QY,You JJ,Lin JF,et al.A high-throughput detection method of ergothione in Ganoderma spp.[J].Nat Prod Res Dev,2022,34:114-120.