背景[1-3]
新型PROTEIN A固定纖維素樹脂,用于抗體純化是一種新型Protein A的固定纖維素樹脂，Protein A經(jīng)過修飾后可以與免疫球蛋白Fc域特異性結(jié)合。使用這種新型Protein A，在溫和條件下即可洗脫抗體。強(qiáng)耐堿性和高抗體結(jié)合能力，可用于抗體純化。
新型PROTEIN A固定纖維素樹脂設(shè)計用于從生物液體和細(xì)胞培養(yǎng)基中簡易地一步純化免疫球蛋白，包括各個亞型IgG或者IgG片段。
新型PROTEIN A 固定纖維素樹脂
來源于大腸桿菌表達(dá)的重組ProteinA與天然ProteinA有著相同的功能，它含有4個可以和各個種屬IgG分子的Fc段高特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。ProteinA是純化兔、豚鼠、狗和貓IgG的首選。Abbkine優(yōu)化的偶聯(lián)配方，確保了抗體產(chǎn)量，穩(wěn)定性以及可溶性的達(dá)到平衡。
ProteinA是一種來源于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁蛋白，由五IgG結(jié)合區(qū)域組成，其分子量為42kDa。ProteinA能夠結(jié)合大多數(shù)免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)域，也可以結(jié)合人類VH3家族的Fab區(qū)域。如果在血清中發(fā)生這樣的相互作用，IgG蛋白將會被錯誤的結(jié)合，細(xì)菌便借此擾亂了機(jī)體的調(diào)理素作用和正常生理機(jī)能。
抗體親和純化的基礎(chǔ)是protein G和protein A對不同物種IgG的Fc區(qū)域的高親和力和特異性。帶有固定在一些不同基質(zhì)的protein G和protein A的層析介質(zhì)，從而提供一種從腹水、細(xì)胞培養(yǎng)上清和血清中分離IgG和IgG亞類的卓越方法。
帶有重組protein L配體的層析介質(zhì)用于抗體和抗體片段的純化。Protein L對kappa輕鏈的可變區(qū)有很強(qiáng)的親和力，能夠廣泛用于捕獲抗體片段比如Fab片段、單鏈可變區(qū)片段（scFv）和結(jié)合域抗體（Dabs）。
應(yīng)用[4][5]
用于抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立研究
通過獲得高質(zhì)量雜交瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上,運(yùn)用抗體重組技術(shù)獲得兔單克隆抗體,以使收集得到的兔單克隆抗體的免疫捕獲能力進(jìn)一步提高最終建立一種檢測GNA蛋白的基于兔單克隆抗體雙抗夾心ELISA檢測體系。
其主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下：（1）抗GNA兔多克隆抗體的制備及鑒定運(yùn)用SDS-PAGE凝膠電泳對GNA免疫抗原蛋白的分子量和純度進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,GNA蛋白分子量約為14.3KDa,且純度較高,可作為獨(dú)立的抗原引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。用BCA蛋白檢測試劑盒測得GNA蛋白的濃度為1.64mg/mL。采用免疫技術(shù),將GNA蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后注射入兩只兔子（B3365,B3366）體內(nèi)。
經(jīng)五次免疫之后選擇免疫效價較高的兔子（B3366）,取全血,經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化兔多抗血清,并對其純度和效價分別進(jìn)行凝膠電泳和間接ELISA檢測。結(jié)果表明,所獲得的抗GNA兔多克隆抗體純度較高,幾乎不含其它雜蛋白,效價在8000～32000之間。
（2）抗GNA兔單克隆抗體的制備及鑒定免疫兩只兔子（B3365,B3366）,選取效價較高的B3366號兔子的脾臟進(jìn)入細(xì)胞融合階段。
（3）將兔子脾臟淋巴細(xì)胞與240E骨髓瘤細(xì)胞融合。運(yùn)用間接ELISA法,經(jīng)過初篩復(fù)篩,獲得雙陽性克隆子6個（zju-17-2、zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17）,取其中三個（zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6）進(jìn)入抗體質(zhì)粒重組階段,選取分泌單克隆抗體能力強(qiáng)且抗體親和性高的配對（zju-17-5（2L/2H））,進(jìn)入單克隆抗體的大轉(zhuǎn)生產(chǎn),最后將收集到的抗GNA兔單克隆抗體經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化。
經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析,證實(shí)了該兔單克隆抗體的純度高,運(yùn)用IgG檢測技術(shù)和間接ELISA檢測技術(shù),分別獲得該目標(biāo)抗體的初始濃度為2.28mg/mL,效價在32000～128000之間,親和常數(shù)為0.387×109L/mol。
參考文獻(xiàn)
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[4]Pyramided rice lines harbouring Allium sativum（asal）and Galanthus nivalis（gna）lectin genes impart enhanced resistance against major sap-sucking pests[J].Y.Bharathi,S.Vijaya Kumar,I.C.Pasalu,S.M.Balachandran,V.D.Reddy,K.V.Rao.Journal of Biotechnology.2011(3)
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