背景^[1-3]

三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基是一種細菌培養(yǎng)基，主要是用來鑒別沙門氏與志賀氏菌屬等腸道桿菌，主要成分包括有牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、乳糖、硫酸亞鐵、氯化鈉、硫代硫酸鈉、酚紅、瓊脂、蒸餾水等。如同時含1%蔗糖，即成三糖鐵培養(yǎng)基。

三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖，只能利用葡萄糖的細菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸使斜面先變黃，但因量少，生產(chǎn)的少量酸。因接觸空氣而氧化，加之細菌生長利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態(tài)，酸類不被氧化，仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細菌，則產(chǎn)生大量的酸，使整個培養(yǎng)基呈黃色。另外，因某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵沉淀。

三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基

成分的作用：

①蛋白胨、牛肉膏：為主要氮源，供細菌合成菌體蛋白質(zhì)，以供生長繁殖之用(亦可供給能量)，也有維持滲透壓的作用。

②葡萄糖：為主要碳源，供給細菌新陳代謝活動所需要的能量。

③氯化鈉：供細菌生長需要的無機鹽，其作用為維持滲透壓、構(gòu)成菌體成分和酶的激動劑。

④枸櫞酸鈉：為抗凝劑，不使血液凝固成塊，因此，可減少白細胞對病原菌的吞噬機會。

⑤對氨苯甲酸：能中和血中磺胺類藥物的抑菌作用。

⑥硫酸鎂：能破壞血中四環(huán)素、金霉素、土霉素、新霉素及多粘菌素等的抑菌作用。

⑦青霉素酶：可破壞青霉素。

⑧酚紅：為指示劑，細菌生長后分解葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH降低，酚紅指示劑變黃，培養(yǎng)液呈黃色，即可知有細菌生長。

應(yīng)用^[4][5]

用于一種耐藥變形桿菌的分離、鑒定及其免疫學(xué)效應(yīng)的實驗研究

采用腸道菌選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基分離泌尿系統(tǒng)反復(fù)感染患者的尿液樣本中的變形桿菌，經(jīng)進一步鑒定和傳代減毒后感染小鼠，分析脾細胞體外增殖能力和脾細胞分泌IL-2、IFN-γ水平及抗體變化；并通過流式細胞儀、酶聯(lián)免疫斑點試驗分析乙肝病人外周血樹突細胞信號分子表達和IFN-γ水平變化，探討變形桿菌對細胞免疫和體液免疫的影響，為變形桿菌菌苗研究奠定了實驗基礎(chǔ)。

方法1．留取泌尿系統(tǒng)反復(fù)感染患者的尿液樣本，將所取樣品用分區(qū)劃線法分別接種于腸道菌選擇培養(yǎng)基（S，S瓊脂）及鑒別培養(yǎng)基（伊紅美藍瓊脂）平皿中，置37℃溫箱培養(yǎng)18～24小時后，觀察菌落特征，在培養(yǎng)后的平皿中找到符合變形桿菌菌落特點的菌落。將挑出的菌落做進一步的鑒定。

2．用Blendon鍍銀染色后觀察、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗、動力靛基質(zhì)尿素酶試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗對挑出的菌落作初步鑒定。

3．從泌尿系統(tǒng)反復(fù)感染患者的尿液樣本中分離的變形桿菌通過特殊的處理，將原有的毒性減低，并做毒性試驗以證明其毒性的降低。再用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基試驗、動力靛基質(zhì)尿素酶試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、遷徙生長試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、液化明膠試驗、西蒙枸櫞酸鹽試驗、吲哚試驗、氨基酸脫羧酶試驗、糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗（麥芽糖、木糖）、對氯霉素的敏感性試驗對特殊處理后的菌種進行最后鑒定。鑒定無誤后將經(jīng)特殊處理的菌種接種、培養(yǎng)、采集、殺菌、離心、純化，稀釋成2×1011／mL的原液，并對原液進行無菌試驗和原液檢定。

4．將變形桿菌原液用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成2×1010／mL。采集慢性乙型肝炎患者和健康人肝素抗凝外周血，分離外周血單個核細胞，并體外定向誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)樹突狀細胞。對照組為RPMI-1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）500μL+培養(yǎng)的樹突細胞；實驗組為RPMI-1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）500μL+培養(yǎng)的樹突細胞+變形桿菌稀釋液，用流式細胞儀檢測CD80，CD86的表達水平。

參考文獻

[1]Detection of Cellular Immunity to Rabies Antigens in Human Vaccinees[J].Susan M.Moore,Melinda J.Wilkerson,Rolan D.Davis,Carol R.Wyatt,Deborah J.Briggs.Journal of Clinical Immunology.2006(6)

[2]The flavonoid ellagic acid from a medicinal herb inhibits host immune tolerance induced by the hepatitis B virus-e antigen[J].Eun Hwa Kang,Tae Young Kown,Goo Taeg Oh,Weung Feel Park,Sung-Il Park,Sung Kyu Park,Young Ik Lee.Antiviral Research.2006(2)

[3]Different composition of intrahepatic lymphocytes in the immune‐tolerance and immune‐clearance phase of chronic hepatitis B[J].D.Sprengers,R.G.van der Molen,J.G.Kusters,B.Hansen,H.G.M.Niesters,S.W.Schalm,H.L.A.Janssen.J.Med.Virol..2006(5)

[4]Hepatitis B virus‐induced defect of monocyte‐derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response in vitro:mechanisms for viral immune escape[J].SusanneBeckebaum,Vito R.Cicinnati,XiaZhang,StanislavFerencik,AndreaFrilling,HansGrosse‐Wilde,Christoph ErichBroelsch,GuidoGerken.Immunology.2003(4)

[5]王鵬.一種耐藥變形桿菌的分離、鑒定及其免疫學(xué)效應(yīng)的實驗研究[D].軍醫(yī)大學(xué),2007.