背景^[1-3]

虎紅（孟加拉紅）瓊脂可用于霉菌和酵母的計(jì)數(shù)、分離和培養(yǎng)，配方（g/L) 蛋白胨5g；葡萄糖10g；磷酸二氫鉀1g；硫酸鎂0.5g；瓊脂15g；孟加拉紅0.03g；氯霉素0.1g；最終pH 7.2±0.2。

原理：蛋白胨提供碳源和氮源;葡萄糖提供能源;磷酸二氫鉀為緩沖劑;硫酸鎂提供必須的微量元素;瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑;氯霉素可抑制細(xì)菌的生長;孟加拉紅作為選擇性抑菌劑可抑制細(xì)菌的生長，并可減緩某些霉菌因生長過快而導(dǎo)致菌落漫延生長。

用法：1、稱取孟加拉紅(虎紅）瓊脂31.6g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌20min。

2、無菌操作稱取檢樣25克(或25mL)，放入含有225mL滅菌水的玻璃三角瓶中，振搖30min，即為1：10稀釋液，依次做1：100、1：1000……稀釋。

3、根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，選擇2—3個(gè)合適的稀釋度，分別在做10倍稀釋的同時(shí)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿。

4、將涼至45℃左右的培養(yǎng)基注入平皿中，待瓊脂凝固后，倒置于25—28℃溫箱中培養(yǎng)。

5、3d后開始觀察結(jié)果，共培養(yǎng)觀察5d。

6、計(jì)算方法：通常選擇菌落數(shù)在10—150之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)(如食品衛(wèi)生國家標(biāo)準(zhǔn))，也有選用5—50個(gè)之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)(化妝品衛(wèi)生規(guī)范)，同稀釋度的2個(gè)平皿菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克(或每mL)檢樣中所含霉菌和酵母菌數(shù)。

應(yīng)用^[4][5]

用于煙支霉變微生物的分離與霉變成因研究

以標(biāo)準(zhǔn)GB4789.15食品中霉菌和酵母菌檢驗(yàn)計(jì)數(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)煙葉及煙支中微生物的檢測(cè)方法進(jìn)行了探索，建立了適合煙草/煙支微生物分離計(jì)數(shù)的檢測(cè)方法。

方法包括：以均質(zhì)器拍打處理煙葉樣品，采用PCA、PDA、孟加拉紅、高鹽察氏、DG18五種培養(yǎng)基分離微生物，培養(yǎng)真菌溫度為28℃，培養(yǎng)細(xì)菌溫度為36℃，微生物計(jì)數(shù)方法為平板計(jì)數(shù)法。

通過對(duì)5種品牌煙支進(jìn)行人工促霉研究發(fā)現(xiàn)，在貯存6個(gè)月時(shí)，YD、TY、CY煙支未包裝樣品都出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，且樣品中嗜干霉菌數(shù)量顯著高于同期其他樣品，而JQ、BL煙支在貯存期內(nèi)微生物數(shù)量無顯著增加。研究對(duì)比了正常煙支與霉變煙支微生物的種群和數(shù)量，利用或然事件研究方法確定了5種煙支致霉菌，分別編號(hào)為A1、A2、A3、A4、A5。通過單菌落形態(tài)觀察及顯微鏡孢子和菌絲觀察，初步鑒定得到A1為枝孢霉屬霉菌，A2為曲霉屬黃曲霉菌，A4為青霉屬桔青霉菌，A3、A5未能鑒定種屬。

通過煙支霉變影響因素的分析研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙絲含水率超過13%時(shí)，煙絲中霉菌含量顯著增加，發(fā)生霉變的風(fēng)險(xiǎn)增大；當(dāng)成品煙支包裝密封度低于60mmH2O時(shí)，隨著放置時(shí)間的延長，樣品中微生物數(shù)量顯著增加；當(dāng)成品煙支樣品在溫度28℃、濕度為80%環(huán)境下存放時(shí)，會(huì)引起霉菌的顯著增加，但在溫度和濕度相對(duì)較低的環(huán)境下，微生物數(shù)量不會(huì)顯著增加；成品煙支不同包裝方式可能引起細(xì)菌和酵母菌數(shù)量的差異，但對(duì)霉菌的數(shù)量無明顯影響。

對(duì)成品煙支3個(gè)關(guān)鍵生產(chǎn)工序前后微生物數(shù)量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，料液的加入會(huì)導(dǎo)致微生物數(shù)量的增加，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長，可能引起煙葉的霉變，而其他2個(gè)工序前后微生物數(shù)量無較大差異。

參考文獻(xiàn)

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[3] PCR protocols:a guide to methods and applications.Innis MA et al.San Diego:Academic press.1990

[4] Moulds.David Malloch.University of Toronto Press.1984

[5]謝欣.煙支霉變微生物的分離與霉變成因研究[D].華南理工大學(xué),2014.