背景[1-3]
Anti-FITC抗體是一類可以特異性結(jié)合FITC的單克隆抗體，主要用于檢測(cè)FITC的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
檢測(cè)原理：雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中FITC水平。用純化的FITC抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入FITC，再與HRP標(biāo)記的FITC抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FITC呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中FITC濃度。
FITC形態(tài)為黃色粉末，有吸濕性，是一種生化試劑，也是醫(yī)學(xué)診斷藥物，可對(duì)由地細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。
并且它能與各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中仍有強(qiáng)烈綠色熒光，加酸后析出沉淀，熒光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。
FITC是生化試劑,也是醫(yī)學(xué)診斷藥物,主要用于熒光抗體技術(shù)中的熒光染料,能和各種抗體蛋白結(jié)合,結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性,并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的綠色熒光。用于醫(yī)學(xué),農(nóng)學(xué)和畜牧等方面,可對(duì)由地細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。
應(yīng)用[4][5]
用于灰樹花多糖的FITC熒光標(biāo)記及Caco-2細(xì)胞模型對(duì)其的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)研究
對(duì)灰樹花多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記,并通過(guò)Caco-2細(xì)胞模型對(duì)其吸收與攝入展開研究,為GRN的藥代動(dòng)力深入研究提供幫助。
首先,通過(guò)Sevag及分步沉淀等方法完成GRN初步純化,再經(jīng)DEAE-纖維素和Sephadex G-100凝膠柱層析純化得到GRN純品,經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定純化后多糖含量為95.7%。其次,利用GRN末端的還原性與酪胺(Tyr)完成還原胺化反應(yīng),膜分離去除過(guò)剩Tyr等小分子,獲得純化的GRN-Tyr共價(jià)偶聯(lián)物,再利用GRN-Tyr中Tyr的氨基基團(tuán)與異硫氰酸熒光素(FITC)進(jìn)行親核反應(yīng),完成GRN熒光標(biāo)記,最后通過(guò)Sephadex G-100柱層析獲得純化的GRN-Tyr-FITC。
通過(guò)苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)每步反應(yīng)的產(chǎn)物糖原含量;PAGE電泳比較各反應(yīng)產(chǎn)物遷移率(Rx);紫外光譜掃描跟蹤反應(yīng)產(chǎn)物是Tyr280nm、FITC490nm的特征吸收峰;熒光光譜掃描合成后的GRN-Tyr-FITC激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)。計(jì)算GRN-Tyr-FITC中FITC的取代度,并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明GRN-Tyr、GRN-Tyr-FITC二次標(biāo)記成功;GRN-Tyr-FITC可以熒光定量檢測(cè)(Ex:490nm,Em:520nm),盡管其激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)均有細(xì)微紅移;GRN-Tyr-FITC可在避光4°C條件下穩(wěn)定保存30天;分批合成的GRN-Tyr-FITC取代度達(dá)0.039%~0.060%(W/W)。最后,選用Caco-2細(xì)胞Transwell單層培養(yǎng)模型,可快速模擬腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)多糖能力。
體外建立Caco-2細(xì)胞單層培養(yǎng)模型,并通過(guò)檢測(cè)跨膜電阻(TEER)、顯微形態(tài)觀察及標(biāo)志物滲漏方法保證其完整性和緊密性。
參考文獻(xiàn)
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