背景[1-3]
Anti-FITC抗體是一類可以特異性結合FITC的單克隆抗體，主要用于檢測FITC的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學實驗。
檢測原理：雙抗體夾心法測定標本中FITC水平。用純化的FITC抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入FITC，再與HRP標記的FITC抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FITC呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中FITC濃度。
FITC形態(tài)為黃色粉末，有吸濕性，是一種生化試劑，也是醫(yī)學診斷藥物，可對由地細菌病毒和寄生蟲等所致疾病進行快速診斷。
并且它能與各種抗體蛋白結合，結合后的抗體不喪失與一定抗原結合的特異性，并在堿性溶液中仍有強烈綠色熒光，加酸后析出沉淀，熒光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。
FITC是生化試劑,也是醫(yī)學診斷藥物,主要用于熒光抗體技術中的熒光染料,能和各種抗體蛋白結合,結合后的抗體不喪失與一定抗原結合的特異性,并在堿性溶液中具有強烈的綠色熒光。用于醫(yī)學,農學和畜牧等方面,可對由地細菌病毒和寄生蟲等所致疾病進行快速診斷。
應用[4][5]
用于灰樹花多糖的FITC熒光標記及Caco-2細胞模型對其的吸收與轉運研究
對灰樹花多糖進行熒光標記,并通過Caco-2細胞模型對其吸收與攝入展開研究,為GRN的藥代動力深入研究提供幫助。
首先,通過Sevag及分步沉淀等方法完成GRN初步純化,再經DEAE-纖維素和Sephadex G-100凝膠柱層析純化得到GRN純品,經苯酚-硫酸法測定純化后多糖含量為95.7%。其次,利用GRN末端的還原性與酪胺(Tyr)完成還原胺化反應,膜分離去除過剩Tyr等小分子,獲得純化的GRN-Tyr共價偶聯(lián)物,再利用GRN-Tyr中Tyr的氨基基團與異硫氰酸熒光素(FITC)進行親核反應,完成GRN熒光標記,最后通過Sephadex G-100柱層析獲得純化的GRN-Tyr-FITC。
通過苯酚硫酸法跟蹤檢測每步反應的產物糖原含量;PAGE電泳比較各反應產物遷移率(Rx);紫外光譜掃描跟蹤反應產物是Tyr280nm、FITC490nm的特征吸收峰;熒光光譜掃描合成后的GRN-Tyr-FITC激發(fā)波長與發(fā)射波長。計算GRN-Tyr-FITC中FITC的取代度,并對其進行穩(wěn)定性實驗。結果表明GRN-Tyr、GRN-Tyr-FITC二次標記成功;GRN-Tyr-FITC可以熒光定量檢測(Ex:490nm,Em:520nm),盡管其激發(fā)波長、發(fā)射波長均有細微紅移;GRN-Tyr-FITC可在避光4°C條件下穩(wěn)定保存30天;分批合成的GRN-Tyr-FITC取代度達0.039%~0.060%(W/W)。最后,選用Caco-2細胞Transwell單層培養(yǎng)模型,可快速模擬腸道吸收轉運多糖能力。
體外建立Caco-2細胞單層培養(yǎng)模型,并通過檢測跨膜電阻(TEER)、顯微形態(tài)觀察及標志物滲漏方法保證其完整性和緊密性。
參考文獻
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