·研究在試管環(huán)境中測試了7種藥物對新型冠狀病毒的抗性，其中瑞德西韋和氯喹能有效抑制病毒。

·瑞德西韋是美國制藥公司吉利德正在研發(fā)的藥物，目前由中日友好醫(yī)院在武漢牽頭，與制藥公司合作，已經(jīng)投入臨床試驗。

·氯喹的使用已有逾75年歷史，是原用于治療痢疾的藥物，是一種廉價和安全的藥物。

Cell Research雜志在線發(fā)表了來自中國科學院武漢病毒研究所、生物安全大科學研究中心肖庚富，胡志紅及軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所鐘武共同通訊的論文。論文中表示，在體外試驗中，發(fā)現(xiàn)瑞德西韋(Remdesivi)和氯喹(chloroquine)能有效抑制新型冠狀病毒。

尋找“解藥”的有效方式，就是測試現(xiàn)有的抗病毒藥物能否有效治療新的病毒，研究中使用了7種常見的抗病毒相關藥物，其中有5種是經(jīng)過FAD批準的藥物——利巴韋林(ribavirin)、潘昔洛韋(penciclovir)、硝唑尼特( nitazoxanide,)、萘莫司他(nafamostat)、氯喹(chloroquine)，另外還有兩種注明的廣譜抗病毒藥物瑞德西韋(remdesivir,GS-5734) 和法匹拉韋( favipiravir)，來測試出他們對臨床分離的新型冠狀病毒的細胞毒性。

研究發(fā)現(xiàn)在Vero E6細胞上，瑞德西韋（Remdesivir, GS-5734）和氯喹（Chloroquine）在細胞水平上能有效抑制新型冠狀病毒的感染，其在人體上的作用還有待臨床藥物。其他的5種藥物對抗新型冠狀病毒的感染都不太理想。

體外實驗證實瑞德西韋和氯喹可抑制新型冠狀病毒

瑞德西韋(Remdesivir)是美國制藥公司吉利德正在研發(fā)的藥物，它本是針對埃博拉病毒進行研發(fā)的。在美國首例病患的診療過程中，它在患者情況惡化是被臨床應用，隨后患者迅速好轉。

氯喹則是一種原用于治療瘧疾的藥物，在臨床應用上已經(jīng)有超過75年的歷史。氯喹除了具有抗病毒活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)活性，這可能會協(xié)同增強其在體內(nèi)的抗病毒作用。氯喹經(jīng)口服后廣泛分布于全身，包括肺，是一種廉價和安全的藥物。

2019年12月，擁有一千一百萬人口的中國中部城市武漢，出現(xiàn)了一種由先前未知的病原體引起的新型肺炎。最初的病例與武漢市海鮮市場的暴露有關。截至2020年1月27日，中國當局報告在中國大陸確診2835例病例，包括81例死亡。此外，在香港，澳門和臺灣發(fā)現(xiàn)了19例確診病例，在泰國，日本，韓國，美國，越南，新加坡，尼泊爾，法國，澳大利亞和加拿大發(fā)現(xiàn)了39例輸入病例。該病原體很快被鑒定為新型冠狀病毒（2019-nCoV），與嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒（SARS-CoV）密切相關。目前，尚無針對這種新病毒的特異性治療方法。因此，迫切需要找到有效的抗病毒藥物來對抗這種疾病。

一種有效藥物的發(fā)現(xiàn)方法是測試現(xiàn)有的抗病毒藥物是否能有效治療相關病毒感染。2019-nCoV屬于乙型冠狀病毒，也包含SARS-CoV和中東呼吸綜合征CoV（MERS-CoV）。 SARS或MERS患者使用了幾種藥物，例如利巴韋林，干擾素，洛匹那韋-利托那韋，皮質類固醇，盡管有些藥物的療效尚存爭議。在這項研究中，我們評估了五種FAD批準藥物的抗病毒功效包括利巴韋林，潘昔洛韋，硝唑尼特，萘莫司他，氯喹和兩種針對2019-nCoV臨床分離株的廣譜抗病毒藥物瑞德昔韋（GS5734）和法維拉韋（T-705）。

研究人員進行了標準測定以測量這些化合物對2019-nCoV的細胞毒性、病毒產(chǎn)量和感染率的影響。首先，通過CCK8分析確定候選化合物在Vero E6細胞（ATCC-1586）中的細胞毒性。然后，在不同濃度的測試藥物存在下，用nCoV——2019BetaCoV / Wuhan / WIV04 / 20192感染Vero E6細胞，感染復數(shù)（MOI）為0.05。在對照中使用DMSO。通過定量實時RT-PCR（qRT-PCR）測定細胞上清液中的病毒拷貝數(shù)來評估功效，并在感染后（pi）48小時通過免疫熒光顯微鏡通過可視化病毒核蛋白（NP）的表達進行確認（細在感染的這個時間點并未觀察到細胞病變）。在這7種受試藥物中，高濃度的三種核苷類似物包括利巴韋林（半有效濃度（EC50）= 109.50μM，半細胞毒性濃度（CC50）> 400μM，選擇性指數(shù)（SI）> 3.65），潘昔洛韋（EC50 = 95.96 μM，CC50> 400μM，SI> 4.17）和法匹拉韋（EC50 = 61.88μM，CC50> 400μM，SI> 6.46）才能減少病毒感染（圖1a和補充信息，圖S1）。然而，法匹拉韋已顯示出100％的有效保護小鼠抵抗埃博拉病毒的攻擊，盡管在Vero E6細胞中的EC50值高達67μM，表明可以進行進一步的體內(nèi)研究以評估這種抗病毒核苷。 萘莫司他(是一種有效的MERS-CoV抑制劑，可防止膜融合，可抑制2019-nCoV感染（EC50 = 22.50μM，CC50> 100μM，SI> 4.44）。硝唑尼特（Nitazoxanide）是一種具有商業(yè)潛力的原生動物藥物，具有針對包括人和動物冠狀病毒在內(nèi)的多種病毒的抗病毒潛力，可在低微摩爾濃度下抑制2019-nCoV（EC50 = 2.12μM; CC50> 35.53μM; SI> 16.76）。建議對該藥物針對2019-nCoV感染進行進一步的體內(nèi)評估。值得注意的是，兩種化合物瑞德昔韋（EC50 = 0.77μM; CC50> 100μM; SI> 129.87）和氯喹（EC50 = 1.13μM; CC50> 100μM，SI> 88.50）在低微摩爾濃度下有效地阻斷了病毒感染并顯示出高SI值（圖1a，b）。

瑞德昔韋最近被公認為是針對培養(yǎng)細胞，小鼠和非人類靈長類動物（NHP）模型中的多種RNA病毒（包括SARS / MERS-CoV5）感染的有前途的抗病毒藥物。目前正在臨床研究中，用于治療埃博拉病毒感染。瑞德昔韋是一種腺苷類似物，可整合到新生的病毒RNA鏈中并導致過早終止。我們的加藥時間分析顯示瑞德昔韋在病毒進入后的一個階段起作用（圖1c，d），這與其作為核苷酸類似物的推定抗病毒機制是一致的。沃倫等的結果表明，在NHP模型中，靜脈內(nèi)施用10 mg / kg劑量的瑞德昔韋可導致其活性形式在血液中持續(xù)存在（10μM），并提供100％的抗埃博拉病毒感染保護作用。我們的數(shù)據(jù)表明瑞德昔韋在Vero E6細胞中針對2019-nCoV的EC90值為1.76μM，這表明在NHP中可能達到其工作濃度。我們的初步數(shù)據(jù)（補充信息，圖S2）表明，瑞德昔韋還可以有效抑制人細胞系（人肝癌Huh-7細胞）中的病毒感染，該細胞系對2019-nCoV.2敏感。

氯喹是一種廣泛使用的抗瘧疾和自身免疫性疾病藥物，最近被報道為潛在的廣譜抗病毒藥物。8氯喹通過增加病毒/細胞融合所需的內(nèi)體pH值以及干擾來阻斷病毒感染，同時也能干擾SARS-CoV受體的糖基化反應。我們的添加時間分析表明，氯喹在Vero E6細胞中2019-nCoV感染的進入和進入后階段均起作用（圖1c，d）。除了其抗病毒活性外，氯喹還具有免疫調(diào)節(jié)能力，可在體內(nèi)協(xié)同增強其抗病毒作用?？诜螅揉瓘V泛分布于整個身體，包括肺。氯喹對Vero E6細胞中2019-nCoV的EC90值為6.90μM，這在風濕性關節(jié)炎患者接受500毫克給藥的血漿中可證明是臨床上可實現(xiàn)的。氯喹是一種便宜且安全的藥物使用了70多年，因此，它可能在臨床上適用于2019-nCoV。

我們的發(fā)現(xiàn)表明，瑞德昔韋和氯喹在體外控制2019-nCoV感染方面非常有效。由于這些化合物已用于人類患者，并具有安全跟蹤記錄，還顯示出對各種疾病的有效效果，因此我們建議應在患有新型冠狀病毒疾病的人類患者中對它們進行評估。

體外實驗證實瑞德西韋和氯喹可抑制新型冠狀病毒

測試藥物在體外對2019-nCoV的抗病毒活性。在不同劑量的所示抗病毒藥物治療中，將Vero E6細胞以MOI為0.05水平的2019-nCoV進行感染，持續(xù)48小時。然后通過qRT-PCR測定細胞上清液中的病毒產(chǎn)量。通過CCK-8測定法測量了這些藥物對Vero E6細胞的細胞毒性。圖a的左和右Y軸分別代表對病毒產(chǎn)量的抑制和藥物的細胞毒性的平均％。實驗一式三份進行。 圖b為使用瑞姆昔韋和氯喹后病毒感染的免疫熒光顯微鏡檢查。如上所述藥物治療有效。感染后48 h，固定感染的細胞，然后用兔血清針對蝙蝠SARS相關CoV的NP作為一抗，并用Alexa 488標記的山羊抗兔IgG（1：500; Abcam）作為二抗。細胞核用赫斯特染料染色。條為100μm。 圖c和d為瑞地昔韋和氯喹的添加時間實驗。對于“全過程治療”，將Vero E6細胞用藥物預處理1小時，然后添加病毒使其附著2小時。之后，去除病毒和藥物的混合物，并用含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，直到實驗結束。對于“進入治療”，在病毒附著前將藥物添加到細胞中1小時，然后在p.i. 2 h，將病毒-藥物混合物替換為新鮮培養(yǎng)基，并保持到實驗結束。對于“進入后”實驗，藥物在p.i. 2 h加入，并保持到實驗結束。對于所有實驗組，將細胞用2019-nCoV感染，MOI為0.05，并通過qRT-PCR c測量感染細胞上清液中的病毒產(chǎn)量，并在14 h p.i時通過Western blot d分析感染細胞中的NP表達。

通訊作者：中國科學院武漢病毒研究所/生物安全大科學研究中心肖庚富、胡志紅及軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所鐘武

發(fā)布日期：2020年2月4日

發(fā)布渠道：Cell Research

原文地址：https://www.nature.com/articles/s41422-020-0282-0

原文標題：Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro