背景及概述^[1]

兒茶素是茶葉中含量豐富且功能重要的一類物質(zhì)，其成分主要包括表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-EGCG]等，而(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯是兒茶素中最有效的活性成分，約占綠茶毛重的8%~13%，也是兒茶素中含量最高的組分。(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯是α-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，具有酚類抗氧化的通性，其分子結(jié)構(gòu)中有6個鄰位的酚羥基，因此有優(yōu)于其它兒茶素的許多性質(zhì)。并具有抗菌消炎、抗氧化和抗突變的作用，也可用作為腫瘤多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，能夠改善癌細(xì)胞對化療的敏感性，減輕對心臟的毒性，還有保護內(nèi)皮的作用，可以有效促進血管舒張，減少心血管疾病的發(fā)生。高純度(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯與茶多酚提取物相比，具有有效成分明確、沒有雜質(zhì)副作用干擾、活性更強等優(yōu)點，因此分離純化(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯具有重要意義。目前，(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯的主要分離方法主要有HPLC分離、葡萄糖凝膠分離、超臨界流體萃取、柱層析法等。由于吸附型填料價格便宜，具有吸附能力強、解吸容易、穩(wěn)定性高、可再生、反復(fù)使用等優(yōu)點。

生物活性^[2]

綠茶及其提取物具有較強的減重減脂功效，早在1999年發(fā)現(xiàn)綠茶提取物干預(yù)可顯著提升年輕男性的能量消耗和脂肪氧化水平。一些基于細(xì)胞水平和動物模型的實驗也揭示了綠茶和兒茶素在減重減脂中的作用。例如，研究表明EGCG可以通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，激活A(yù)MPK通路，以降低3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力并抑制前脂肪細(xì)胞的分化能力，以此減少脂肪生成，控制脂肪組織的擴張。通過對雄性DIO小鼠進行食源性EGCG干預(yù)，表明EGCG可增加脂肪氧化水平，且EGCG以劑量依賴性的方式減少大鼠的內(nèi)臟脂肪重量。研究表明，在飼喂高脂膳食的大鼠中補充食源性EGCG（3.2g/kgfood），飼喂16周后大鼠的體重減輕，附睪脂肪系數(shù)減少，F(xiàn)FAs和空腹胰島素水平明顯下降。綜合前人的研究基礎(chǔ)，EGCG的減重減脂機制分為直接機制和間接機制兩種。直接機制為EGCG對消化器官的影響，如通過抑制消化酶活性、改變腸道菌群等方式抑制營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。而間接機制則是EGCG通過調(diào)節(jié)AT、肌肉組織、肝臟組織中與肥胖相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)。

(1)直接機制

EGCG可以通過下調(diào)消化酶的活性，抑制營養(yǎng)物的消化和吸收以達(dá)到減重目的。在體內(nèi)外研究中已經(jīng)，證實兒茶素可下調(diào)胰腺α-淀粉酶、葡糖苷酶以及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白等消化酶的活性。研究表明EGCG等沒食子酰化的兒茶素由于同Na+葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白的競爭性抑制，可抑制腸細(xì)胞吸收葡萄糖。EGCG通過與胰腺α-淀粉酶的疏水締合和氫鍵合成抑制α-淀粉酶的活性。脂質(zhì)在小腸中被乳化、水解和吸收，小腸頂端表面上的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白促進脂肪酸和膽固醇轉(zhuǎn)移到腸細(xì)胞中，吸收的脂質(zhì)被包裝在乳糜微粒中并分泌到淋巴系統(tǒng)中。許多研究已經(jīng)證明茶多酚可以干擾脂質(zhì)乳化過程并抑制胰脂肪酶和磷脂酶的活性。例如，研究表明EGCG干預(yù)使得HFD小鼠糞便中脂質(zhì)含量增加，這表明脂質(zhì)的吸收受到抑制，且他們在體外研究中證明EGCG以非競爭性的方式劑量依賴性地抑制胰脂肪酶的活性。食源性EGCG可通過改變腸道微生物群的構(gòu)成，影響某些種類的腸道微生物群的生長，來調(diào)控能量代謝。通過在HFD誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠的高脂日糧中補充4%綠茶粉末，發(fā)現(xiàn)綠茶攝入可有效減少小鼠的體重，減少肝臟中甘油三酯和膽醇的聚集，這種減少與小腸微生物群體中Akkermansia的量和/或小腸中總微生物的量相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，綠茶消費可增加人類腸道微生物群中雙歧桿菌的比例，而雙歧桿菌的數(shù)量與葡萄糖耐量的改善和胰島素敏感性的增強呈正相關(guān)。研究表明，在大鼠飲食中加入0.6%EGCG（w/w），飼喂4周后，大鼠糞便中的淀粉和蛋白質(zhì)含量較對照組有明顯的升高，這表明食源性EGCG干預(yù)影響淀粉和蛋白質(zhì)的吸收，且大鼠的VAT相對重量減少，通過研究大鼠腸道微生物組成，發(fā)現(xiàn)EGCG干預(yù)減少了梭菌屬微生物的數(shù)量并增加了擬桿菌數(shù)量。

(2)間接機制

許多細(xì)胞水平實驗和動物模型研究已經(jīng)表明EGCG可通過影響肝臟、肌肉與脂肪組綠茶的健康效益取決于茶中組分特別是EGCG的生化特性和生物利用度。通常認(rèn)為EGCG是強抗氧化劑，能夠有效清除自由基并抑制活性氧（ROS）的形成。然而，在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，EGCG可自動氧化阻斷線粒體電子傳遞產(chǎn)生H2O2等ROS，ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡，體外培養(yǎng)中可通過加入過氧化物歧化酶（SOD）來抑制EGCG的自氧化。在人體和動物體內(nèi)，由于組織內(nèi)存在抗氧化酶并且組織內(nèi)的氧分壓低于體外培養(yǎng)環(huán)境，通常認(rèn)為在內(nèi)不易出現(xiàn)EGCG自氧化現(xiàn)象。EGCG在體外培養(yǎng)環(huán)境中的自氧化現(xiàn)象表明EGCG具有作為促氧化劑和抗氧化劑的雙重功能，EGCG的抗氧化和促氧化作用可由它的有效濃度介導(dǎo)。如在體外培養(yǎng)的人體淋巴細(xì)胞中，濃度范圍為1~100μM的EGCG增加了過氧化氫所誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂，但在0.01~0.1μM的較低濃度范圍內(nèi)EGCG抑制了DNA斷。EGCG的生物利用度也是影響EGCG有益功效的因素之一。人體和動物模型研究表明，表兒茶素和兒茶素的生物利用度要大于EGCG，在小鼠胃內(nèi)施用75mg/kgEGCG后，小鼠血漿中EGCG濃度較低，超過50%的EGCG以葡糖苷酸軛合物的形式存在。在人體內(nèi)，每天攝入2-3杯綠茶后，血漿中兒茶素水平的峰值為0.2~0.3μM，口服高劑量的EGCG后血漿中EGCG濃度的峰值可達(dá)2~9μM。因此，為實現(xiàn)EGCG的有益功效，可從綠茶中分離提純EGCG用于新藥和保健品加工中。

制備^[1]

1）茶多酚的浸提與分離

將10g茶葉在烤箱中進行烘干后碾成碎末狀，在漏斗出口堵上脫脂棉后，將茶葉裝入恒壓滴液漏斗中，并向其中裝入無水乙醇。使用循環(huán)冷凝裝置并用水浴加熱，溫度在87℃左右。當(dāng)有冷凝液滴出時，開始計時，2h后，改換蒸餾裝置濃縮提取液。向提取液中加入活性炭粉末后進行脫色，抽濾并收集濾液，用10%的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)濾液的pH，再向其中加入一定比例的乙酸乙酯與水進行萃取，取上層油酯層并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙酸乙酯，干燥，得茶多酚粗品。

2）聚酰胺的預(yù)處理

將聚酰胺置于乙醇中攪拌，并進行24h的浸泡處理，過濾后，濾餅每次使用20mL的乙醇沖洗3次（乙醇可回收并重復(fù)使用）。將處理好的聚酰胺倒入層析柱中使聚酰胺自然沉降，放出柱內(nèi)多余的乙醇溶液，使液面略高于聚酰胺顆粒表面后關(guān)閉活塞，再分別用濃度為5%的NaOH溶液、10%的醋酸溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗至流出液pH為7。

3）(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯的分離與收集

將所得的茶多酚粗品加適量蒸餾水溶解后上聚酰胺柱。先用100mL蒸餾水洗脫，控制流速為4mL/min，當(dāng)層析柱內(nèi)液面略高于聚酰胺柱體高度時，使用一定濃度的乙醇—水溶液進行洗脫，流速為3.0mL/min，至洗脫完全。將含(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯的流份合并，回收乙醇，在40℃的溫度下進行蒸發(fā)干燥，回收得(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯固體粉末。

主要參考資料

[1] 中國茶葉大辭典

[2] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞極化的影響

[3] 表沒食子兒茶素沒食子酸酯的提取分離工藝研究