RNA修飾，如N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A），已被證明在生理或病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能。5-甲基胞嘧啶(m5C)也被報(bào)道參與RNA代謝調(diào)控。特別是，m5C不僅在核糖體RNA和轉(zhuǎn)移RNA中被檢測(cè)到，而且在信使RNA中也通過基于高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組范圍的作圖方法被檢測(cè)到。據(jù)報(bào)道，mRNA中的m5C修飾是由NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2 (NSUN2)催化的，在mRNA的翻譯起始位點(diǎn)附近、3’UTRs和Argonaute結(jié)合區(qū)域附近有明顯的富集。在病理?xiàng)l件下，特別是在人實(shí)體腫瘤中，對(duì)m5C等RNA修飾的分子動(dòng)力學(xué)和/或功能仍缺乏詳細(xì)的研究。

人類膀胱尿路上皮癌(UCB)，包括兩大類臨床病理類型的非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌(NMIBC);pTa/1)和肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌(MIBC，pT2–pT4)，提供了一個(gè)理想的模型系統(tǒng)來研究腫瘤發(fā)生和/或腫瘤進(jìn)展的多階段特征。在這項(xiàng)研究中，我們提供了人類UCBs中mRNA m5C修飾的單核苷酸解析圖，并揭示NSUN2和Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）作為m5C的特定“作者”和“讀者”，分別通過靶向其3’UTR上的m5c修飾位點(diǎn)，穩(wěn)定肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子(HDGF)的癌基因mRNA，從而在UCB中發(fā)揮重要的致癌作用。因此，我們的研究結(jié)果闡明了RNA m5c介導(dǎo)的癌基因激活在UCB發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控機(jī)制，并為靶向UCB中的NSUN2/YBX1/m5C-HDGF信號(hào)軸提供了治療理論依據(jù)。

研究結(jié)果

1.RNA m5C在UCB組織中的分布

為了在UCBs中繪制單堿基分辨率下的轉(zhuǎn)錄組m5C修飾圖，我們對(duì)36個(gè)UCB和29個(gè)鄰近正常組織(包括22對(duì)癌變和非癌變膀胱組織)進(jìn)行了改進(jìn)的RNA亞硫酸氫鹽測(cè)序(RNA- BisSeq)方法。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)m5C位點(diǎn)(約為90%)存在于mRNA中，并且在在每個(gè)樣本的2,281-8,957個(gè)mRNA中識(shí)別出7,204-115,867個(gè)m5C位點(diǎn)。

每個(gè)樣品中m5C位點(diǎn)的甲基化中值在0.15 ~ 0.23之間。m5C位點(diǎn)在編碼序列和3’UTRs中富集，有趣的是似乎在翻譯起始位點(diǎn)下游的編碼序列區(qū)域富集。序列頻率logo顯示了在GC豐富的區(qū)域中嵌入m5C位點(diǎn)的特征。這些發(fā)現(xiàn)與以前關(guān)于HeLa細(xì)胞和小鼠組織的報(bào)道一致5，8，這表明這些特征不僅在不同物種中高度保守，而且在人類正常組織和腫瘤組織中也高度保守。

2. m5C在UCBs中經(jīng)常高甲基化，并在致癌途徑中富集

我們的RNA-BisSeq數(shù)據(jù)顯示，5280個(gè)m5C位點(diǎn)的甲基化水平在腫瘤和正常組織之間存在顯著差異。其中，2041個(gè)mRNA中有4,126個(gè)m5C位點(diǎn)高甲基化，504個(gè)mRNA中有1,154個(gè)m5C位點(diǎn)在UCBs中相對(duì)于正常對(duì)照組顯示低甲基化，表明m5C位點(diǎn)在UCBs中經(jīng)常高甲基化。與此相一致的是，對(duì)5對(duì)配對(duì)腫瘤和鄰近正常組織的超高效液相色譜-三重四極質(zhì)譜聯(lián)用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(UHPLC-MRM-MS /MS)分析顯示，腫瘤樣本中整體mRNA m5C含量增加。

UCB中頻繁發(fā)生的m5C高甲基化使我們明確了m5C高甲基化mRNA的功能。利用獨(dú)創(chuàng)性途徑分析(IPA)的功能富集分析表明，高甲基化mRNA主要富集于十個(gè)典型的癌癥相關(guān)途徑。基于IPA和之前報(bào)道的研究結(jié)果，這些通路中有6個(gè)(JAK-STAT、ERBB、PI3K-AKT、VEGF、上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和ERK-MAPK)中的103個(gè)基因在腫瘤中甲基化傾向增加。圖1a顯示了50個(gè)代表性基因的熱圖，其中12個(gè)基因在腫瘤中甲基化增加最多(每個(gè)途徑1-3個(gè))(圖1b)。相比之下，m5c -低甲基化基因主要富集于線粒體功能和免疫應(yīng)答相關(guān)通路。綜上所述，m5C高甲基化在UCBs中是一個(gè)頻繁的事件，高甲基化mRNA在致癌通路中富集。

圖1：UCBs中的RNA m5C高甲基化圖

3. m5C高甲基化與UCBs中癌基因mRNA過表達(dá)有關(guān)

為了研究m5C修飾與基因表達(dá)的關(guān)系，我們對(duì)同一隊(duì)列36個(gè)UCBs和29個(gè)鄰近正常組織進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA- seq)，并在UCBs中識(shí)別出m5C位點(diǎn)高甲基化的差異表達(dá)mRNA(600個(gè)上調(diào)，244個(gè)下調(diào))(圖2a)。有趣的是，幾個(gè)致癌基因，即HDGF、F11受體(F11R)、RAB11家族相互作用蛋白4 (RAB11FIP4)和MLLT11, 在UCBs中均表現(xiàn)出m5C高甲基化和mRNA上調(diào)(如圖2b中的HDGF)，并在檢測(cè)的UCBs中表現(xiàn)出顯著相關(guān)性(圖2c)。這種強(qiáng)相關(guān)性在22對(duì)UCB和正常組織中得到進(jìn)一步驗(yàn)證(圖2d,e)。Kaplan-Meier對(duì)癌癥基因組圖譜(TCGA) UCB隊(duì)列中這些癌基因的分析顯示，它們的高表達(dá)水平與無病生存(DFS)降低之間存在正相關(guān);圖2f)。此外，在中山大學(xué)癌癥中心(SYSUCC)的UCB隊(duì)列中，上述致癌基因的m5C水平與NSUN2表達(dá)呈正相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，m5C對(duì)mRNA的修飾可以增強(qiáng)與UCB進(jìn)展相關(guān)的某些癌基因mRNA表達(dá)。

小結(jié)

基因組研究揭示了驅(qū)動(dòng)UCB發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵基因突變，如大多數(shù)NMIBC31病例中的FGFR3激活，以及包括TSC1和CDH1在內(nèi)的腫瘤抑制基因的頻繁失活32,33。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，有58個(gè)基因——包括KMT2C、ATM和fat1——在MIBC中發(fā)生了顯著的突變，總體突變負(fù)荷與APOBEC -signature突變有關(guān)。此外，包括異常DNA甲基化和組蛋白修飾在內(nèi)的表觀遺傳機(jī)制也參與了UCB的發(fā)育14,34。RNA m6A修飾的失調(diào)通過調(diào)節(jié)癌基因表達(dá)在人類癌癥中發(fā)揮著不同的作用。

在此，我們提供了人類UCB中單堿基分辨率RNA m5C的圖譜，并證明RNA m5C高甲基化是UCB中致癌基因激活的另一個(gè)分子事件，這得到了以下證據(jù)的有力支持:

（1）m5C mRNA的高甲基化在癌癥相關(guān)通路中高度富集，如PI3K-AKT35和ERK-MAPK36，與正常組織相比，許多癌基因，如HDGF，在UCB組織中經(jīng)常發(fā)生m5C高甲基化，并且在腫瘤從NMIBC進(jìn)展到MIBC過程中顯著上調(diào)；

（2）m5C writer NSUN2和m5C reader YBX1在UCBs中異常升高，從而通過增強(qiáng)HDGF mRNA在m5C位點(diǎn)依賴機(jī)制中的穩(wěn)定性，促進(jìn)UCB的發(fā)病機(jī)制；

（3）除UCB外，其他類型的實(shí)體腫瘤HDGF與YBX1表達(dá)均有顯著相關(guān)性。此外，在UCB和其他實(shí)體腫瘤中，NSUN2、YBX1和HDGF這三種蛋白的高表達(dá)預(yù)測(cè)了最低的存活率。

綜上所述，這些結(jié)果表明RNA m5C高甲基化代表了包括UCB在內(nèi)的人類腫瘤中癌基因激活的一種機(jī)制，并可能作為一種有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物來區(qū)分晚期和/或生存期較差的UCB患者。