超級雜交液（原位雜交用）

產(chǎn)品及特點 

原位雜交是在一定生物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之上的核酸雜交。這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可以是一條染色體；一個細菌；更大結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是細胞和組織。基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或NA-RNA 雙鍵分子，應用帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在并定位；用原位雜交技術(shù)，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。本產(chǎn)品為公司開發(fā)的即用型原位雜交專用核酸雜交液。既可以用于RNA原位雜交、DNA原位雜交，也可以用于FISH原位雜交等試驗。

運輸及保存 低溫運輸和-20℃保存、有效期一年。

自備試劑 蓋玻片、多聚甲醛等
使用方法 以檢測 mRNA 序列為例。培養(yǎng)細胞和冰凍切片

1. 玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或 APES。切片厚度 10-20μm。

2. 細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為 37℃和 5%的 CO2，所用培養(yǎng)基為 Dulbecco 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細胞長好后 0.1M PBS(PH7.4)洗 2分鐘×3 次。

3. 培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為 4%多聚甲醛/0.1 MPBS （PH7.2-7.6），含有 1/1000 DEPC。室溫固定 20--30 分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存 2 周以上。

4. 30%H2O2 1 份+純甲醇 50 份混合，室溫處理 30 分鐘。蒸餾水洗滌 3 次。

5. 暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml3% 檸檬酸加 2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化 5—120 秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS 洗 3 次×5 分鐘。蒸餾水洗 1 次。

6. 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為 1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有 1/1000 DEPC。室溫固定 10 分鐘。蒸餾水洗滌 3次。

7. 預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持濕度。按每張切片加 20μL 預雜交液（提前加入鮭魚精 DNA，終濃度為100ug/ml）。恒溫箱 38-42℃2—4 小時。吸取多余液體，不洗。

注：靶 DNA 的變性

DNA-DNA 雜交檢測中，在雜交前需要增加靶 DNA 的變性步驟（對 mRNA的原位雜交無需此步）。樣品 DNA 的變性可能會造成樣品形態(tài)學的部分破壞，此步是實驗中需要優(yōu)化的一個步驟。實驗時可以摸索變性時間、變性溫度等參數(shù)以獲得條件?？梢詫⑻结樀淖冃院蜆悠?DNA 變性同步進行：將樣品和探針溶液加蓋蓋玻片，置于烘箱 80℃變性 ，處 理 5-10 min，后冷卻至 37℃進行雜交。

8. 雜交——按每張切片 20μL 雜交液（探針濃度約為 1ng/ul；雜交液提前加入鮭魚精 DNA，終濃度為 100ug/ml），加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱 38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

9. 雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的 2×SSC 洗滌 5 分鐘×2 次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復 0.2×SSC 洗滌 15 分鐘×1-2 次)。

10. 滴加封閉液：37℃30 分鐘。甩去多余液體，不洗。

11. 根據(jù)探針標記物，選擇相應顯色方法顯色、復染，脫水、封片。

12. 結(jié)果觀察。

石蠟切片

如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為 4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有 1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過 4mm 的小塊，固定 1 小時即可，較大的標本固定不要超過 2 小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40 分鐘，一般不要超過 1 小時。

1．常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。切片厚度 6-8μm。

2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或 APES。

3．石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。30%H2O2 1 份+蒸餾水 10 份混合,室溫 5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗 3 次。

4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（1ml3% 檸檬酸加 2 滴濃縮型胃蛋白酶，混勻），37℃或室溫消化 3--30 分鐘（視標本新舊、厚薄自行調(diào)整）。用戶可以比較不同的消化時間，例如 5 分鐘,10 分鐘，20 分鐘，30 分鐘。以找到消化時間。原位雜交用 PBS 洗 3 次×5分鐘。蒸餾水洗 1 次。

5. 其余步驟和冰凍切片 6-11 步相同。

6. 結(jié)果觀察。