保存條件

2~8℃可保存1年。Annexin V-APC禁止冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)原理

Annexin V-APC / PI熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，可用于檢測(cè)懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的凋亡。

Annexin V是一種鈣離子依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸 (PS) 有高度親和力。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被熒光染料APC標(biāo)記的Annexin V結(jié)合，可通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。

本試劑盒檢測(cè)喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡效果如下圖所示：

試劑配制

1×Annexin V Binding Buffer：取1 mL Annexin V Binding Buffer (10×)加入9 mL去離子水中混勻。

實(shí)驗(yàn)操作

一步法

1．  細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，300 ×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗滌一次，輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2．  取1~5 × 10⁵重懸的細(xì)胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入500 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。

3．  細(xì)胞懸液中加入5 μL的Annexin V-APC 染色液和5 μL的PI 染色液 (50μg/mL)。

4．  輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．  立即上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)于冰上避光靜置并于1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

注：流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)Annexin V-APC可用APC通道，PI優(yōu)先選擇ECD通道，其次是PE通道；如果樣本有FITC通道的自發(fā)熒光，則選擇PerCP/Cy5.5通道。

兩步法

1．  細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，300 ×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗滌一次，輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2．  取1~5 × 10⁵重懸的細(xì)胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入100 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。

3．  細(xì)胞懸液中加入2.5 μL的Annexin V-APC染色液和2.5 μL的PI 染色液 (50μg/mL)。（由于兩步法分辨率更高，染色液用量減半依然可得到媲美一步法的效果；用戶(hù)亦可根據(jù)自己的模型進(jìn)行滴定后加入適量的染色液，用更少的量獲得高質(zhì)量的結(jié)果。）

4．  輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．  加入400 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer，混勻樣本。

6．  立即上機(jī)檢測(cè)。如不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)于冰上避光靜置并于1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

注：流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)Annexin V-APC可用APC通道，PI優(yōu)先選擇ECD通道，其次是PE通道；如果樣本有FITC通道的自發(fā)熒光，則選擇PerCP/Cy5.5通道。

注意事項(xiàng)

1.         本產(chǎn)品僅供科研使用。

2.         檢測(cè)貼壁細(xì)胞時(shí)，需收集誘導(dǎo)凋亡后產(chǎn)生的懸浮細(xì)胞，并與后續(xù)收集的貼壁細(xì)胞一起檢測(cè)。

3.         應(yīng)盡量避免消化貼壁細(xì)胞帶來(lái)的機(jī)械損傷。同時(shí)，胰酶的消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因?yàn)?/span>EDTA會(huì)影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。

4.         如果使用含EDTA的胰酶，收集細(xì)胞后應(yīng)充分清洗，確保EDTA被去除干凈。

5.         染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。

6.         熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過(guò)程中也盡量注意避光保存。

7.         為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

(本試劑產(chǎn)品僅供科學(xué)研究或進(jìn)一步生產(chǎn)使用，不可用于臨床診斷或治療)