保存條件

7-AAD染色液適當(dāng)分裝后-5~-20℃可保存1年，其他試劑2~8℃可保存1年。Annexin V-APC禁止冷凍保存。

實驗原理

Annexin V-APC / 7-AAD 熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，可用于檢測懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的凋亡。

Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸 (PS) 有高度親和力。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被熒光染料APC標(biāo)記的Annexin V結(jié)合，可通過流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡進行檢測。

由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，而7-氨基放線菌素D（7-Amino Actinomycin D, 7-AAD）可與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強烈的熒光，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時期的細(xì)胞。

本試劑盒檢測喜樹堿誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡效果如下圖所示：

試劑配制

1×Annexin V Binding Buffer：取1 mL Annexin V Binding Buffer (10×)加入9 mL去離子水中混勻。

實驗操作

一步法

1．  細(xì)胞按照實驗方案進行凋亡誘導(dǎo)，300 ×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗滌一次，輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。

2．  取1~5 × 10⁵重懸的細(xì)胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入500 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。

3．  細(xì)胞懸液中加入5 μL的Annexin V-APC 染色液和5 μL的7-AAD 染色液 (100μg/mL)。

4．  輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．  立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內(nèi)完成檢測。

注：流式細(xì)胞儀檢測時Annexin V-APC可用APC通道，7-AAD選擇PerCP/Cy5.5通道。

兩步法

1．  細(xì)胞按照實驗方案進行凋亡誘導(dǎo)，300 ×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗滌一次，輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。

2．  取1~5 × 10⁵重懸的細(xì)胞，300 ×g離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入100 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞。

3．  細(xì)胞懸液中加入2.5 μL的Annexin V-APC 染色液和2.5 μL的7-AAD 染色液 (100μg/mL)。（由于兩步法分辨率更高，染色液用量減半依然可得到媲美一步法的效果；用戶亦可根據(jù)自己的模型進行滴定后加入適量的染色液，用更少的量獲得高質(zhì)量的結(jié)果。）

4．  輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15~20 min。

5．  加入400 μL稀釋的1 × Annexin V Binding Buffer，混勻樣本。

6．  立即上機檢測。如不能及時檢測，請于冰上避光靜置并于1小時內(nèi)完成檢測。

注：流式細(xì)胞儀檢測時Annexin V-APC可用APC通道，7-AAD選擇PerCP/Cy5.5通道。

注意事項

1.         本產(chǎn)品僅供科研使用。

2.         檢測貼壁細(xì)胞時，需收集誘導(dǎo)凋亡后產(chǎn)生的懸浮細(xì)胞，并與后續(xù)收集的貼壁細(xì)胞一起檢測。

3.         應(yīng)盡量避免消化貼壁細(xì)胞帶來的機械損傷。同時，胰酶的消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因為EDTA會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。

4.         如果使用含EDTA的胰酶，收集細(xì)胞后應(yīng)充分清洗，確保EDTA被去除干凈。

5.         染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。

6.         熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

7.         為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

(本試劑產(chǎn)品僅供科學(xué)研究或進一步生產(chǎn)使用，不可用于臨床診斷或治療)