FITC-Annexin V/PI 細胞凋亡試劑盒 

產(chǎn)品貨號：F6012L 

產(chǎn)品規(guī)格：100T 

產(chǎn)品內(nèi)容：

儲存條件：

4℃避光冷藏，請勿凍存。有效期見外包裝。

光譜特性：

FITC-Annexin V: Ex/Em = 494/518 nm 

PI: Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)

產(chǎn)品介紹：

FITC-Annexin V/PI凋亡試劑盒提供了一種快速簡便的方法，通過標記早期凋亡細胞（綠色）和壞死或晚期凋亡的細胞 （紅色）檢測細胞凋亡水平。產(chǎn)品可以使用流式細胞儀或其它熒光檢測設備進行檢測。 

Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為 35-36KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可于磷脂酰絲氨酸（PS）選擇性結(jié)合。 磷脂酰絲氨酸（PS）主要分布在細胞膜內(nèi)側(cè)，即與細胞漿相鄰的一側(cè)。在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把磷脂 酰絲氨酸外翻到細胞表面，暴露在細胞外環(huán)境中。此時，使用綠色熒光探針 FITC 標記的 Annexin V，即 FITC - Annexin V， 與外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，就可用流式細胞儀或熒光顯微鏡直接檢測到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特 征。對于壞死或晚期凋亡的細胞，由于細胞完整性已經(jīng)被破壞，FITC - Annexin V 則可以進入胞漿與處于磷脂層內(nèi)側(cè)的 PS 結(jié)合，從而也使壞死細胞呈現(xiàn)綠色熒光。 

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞的細 胞核。PI 可以由 488、532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

使用方法：

1. 實驗設計：

空白管：陰性對照組細胞，不加FITC-Annexin V/PI。用于調(diào)節(jié)電壓。

單染管：陽性對照組細胞，只加FITC-Annexin V/只加PI。用于調(diào)節(jié)補償。

檢測管：處理的細胞，加FITC-Annexin V/PI。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。 

2. 收集細胞：

(1) 對于懸浮細胞：

a. 在進行完細胞凋亡刺激后，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。 注：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續(xù) FITC-Annexin V的結(jié)合。 

b. 取5×104 -1×105個重懸的細胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細胞。 

c. 加入5 μL FITC-Annexin V，輕輕混勻。 

d. 加入5 μL PI染色液，輕輕混勻。 

e. 室溫 ( 20-25oC ) 避光孵育10 - 15 min?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。

(2) 對于貼壁細胞：

a. 把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(不含EDTA)消化細胞。室溫孵育 至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。 注：對于貼壁細胞，胰酶消化步驟很關鍵。胰酶消化時間如果過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷， 從而導致細胞壞死的假陽性；消化時間如果過長，同樣易造成細胞膜損傷而出現(xiàn)細胞壞死的假陽性，甚至會影響細胞膜上磷 脂酰絲氨酸與FITC-Annexin V的結(jié)合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。 

b. 加入上步中收集的細胞培養(yǎng)液，把細胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000 rpm離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)。 注：加入上步中的細胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清 可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的 FITC-Annexin V，導致染色失敗。 

c. 取5×104 -1×105個重懸的細胞，1000 rpm離心5 min，棄上清，加入100 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細胞。 

d. 加入5 μL FITC-Annexin V，輕輕混勻。 

e. 加入5 μL PI染色液，輕輕混勻。 

f. 室溫 (20-25oC )避光孵育10 - 15 min。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。 

3. 結(jié)果分析：

(1) 流式細胞儀檢測：

a. 孵育完成后，可直接加入400 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細胞，立即上機檢測， FITC-Annexin V 由488 nm激光激 發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜在530 nm處（FITC 通道），PI通道發(fā)射光譜約在617 nm處。

b. 在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-Annexin V-/PI-）；右下象限為早期凋亡細胞，為（FITCAnnexin V+/PI-）；右上象限是壞死與晚期凋亡細胞，為（FITC-Annexin V+/PI+）；左上象限顯示裸核細胞，為（FITC-Annexin  V-/PI+)。 

(2) 熒光顯微鏡檢測：

a. 1000 rpm離心5 min，收集細胞，用400 μL 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液輕輕重懸細胞。將細胞移至96孔板中沉降片刻或進行 細胞涂片后，置于熒光顯微鏡下觀察。 

b. FITC-Annexin V 可用 FITC適用的濾光片，PI可用 Cy3 或者 Texas適用的濾光片。

注意事項：

1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進行后續(xù)實驗。 

2. 為降低細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至 30 min。 

3. 由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后 1 h 之內(nèi)進行分析。 

4. 對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。 處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜 的損傷，PI 攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與 FITC-Annexin V 的結(jié) 合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間， 待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合。 

5. 貼壁細胞用胰蛋白酶消化后，建議在最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復約 30 min 后染色，避免假陽性。 

6. 為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。 

7. 染料的最佳使用濃度由具體實驗要求確定。 

8. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 

9. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。