乳酸含量（lactic acid，LA）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法50管/24樣

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

乳酸是生物體代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類(lèi)代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。

測(cè)定原理：

乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時(shí)使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，H⁺傳遞給PMS生成的PMSH₂還原INT生成紅色物質(zhì)，在530nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體55mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體5mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體12mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加入1.5mL蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加15mL蒸餾水充分溶解。

試劑五：粉劑×1支，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支，4℃保存。

顯色液：臨用前根據(jù)用量按照提取液（V）：試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（m）=1（mL)：0.3（mL)：3（mL)：15（mg）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少，在棕色瓶中配制，試劑盒中帶有5個(gè)棕色空瓶）

樣本處理：

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取上清測(cè)定。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取上清測(cè)定。

3. 血清：直接測(cè)定。              

測(cè)定操作：

注意：標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管只需測(cè)定一次，每個(gè)樣品測(cè)定管設(shè)一個(gè)樣品對(duì)照管

計(jì)算公式：

1. 按照蛋白含量計(jì)算

LA含量（μmol/mg prot）=△A樣÷△A標(biāo)×C標(biāo)÷ Cpr

                    =2×△A樣÷△A標(biāo)÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

LA含量（μmol/g 鮮重）=△A樣÷△A標(biāo)×C標(biāo)÷ W

                    =2×△A樣÷△A標(biāo)÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

LA含量（μmol/10⁴ cell）=△A樣÷△A標(biāo)×C標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

                    =2×△A樣÷△A標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

LA含量（μmol/mL）=△A樣÷△A標(biāo)×C標(biāo)

                    =2×△A樣÷△A標(biāo)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，2mmol/L ；W：樣本質(zhì)量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL

注意事項(xiàng)

1. 若吸光值超過(guò)2，請(qǐng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 最低檢出限為1.8μmol/L。