順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書

                                      分光光度法50管/48樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應，使羥基由β碳原子轉移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應作準備。

順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒測定原理：ACO催化檸檬酸轉化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD⁺ 還原生成NADH，導致340nm處光吸收上升。

需自備的儀器和用品：紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：
試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：液體5mL×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加3mL蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用

試劑七：粉劑×1支，4°保存；臨用前加36mL試劑四充分溶解；

工作液：臨用前在36mL試劑七中加入3mL蒸餾水、3mL試劑四、3mL試劑五、3mL試劑六充分混勻

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿轉入離心管內600g，4℃離心5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質順烏頭酸酶活性。

5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。

順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）將工作液，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內可用。

（3）在1mL石英比色皿中加入100μL樣本900μL工作液，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值

A1和 3min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

ACO活性計算：

用石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

 ACO活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

 ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=108×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。

ACO活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.722×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.001 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，3min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。