甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試劑盒說明書
分光光度法10管/9樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試劑盒定意義：
MCS廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，與檸檬酸合酶（CS）共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。
測(cè)定原理：
MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體10mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體2mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體0.2mL×1支，-20℃保存；
試劑四：液體10mL×1瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入320μL無水乙醇；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入320μL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
試劑七：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入320μL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。
⑤ 在步驟④中的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測(cè)定。
甲基檸檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試劑盒測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑四、五、六和七在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。
3、樣本測(cè)定
試劑名稱（μL） | 測(cè)定管 |
試劑四 | 780 |
試劑五 | 30 |
試劑六 | 30 |
樣本 | 30 |
試劑七 | 30 |
將上述試劑按順序加入1 mL玻璃比色皿中，加試劑七的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在412nm波長(zhǎng)下記錄20秒時(shí)的初始吸光度A1和反應(yīng)2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
MCS活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=222.2×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。
MCS（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.4444×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
關(guān)鍵字： 甲基檸檬酸合酶（metheyl-citr;甲基檸檬酸合酶（metheyl-citr;
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