胺類、酰胺、氨基甲酸酯、尿素及胍類化合物與亞硝酸鹽或其他含氮試劑（如N?O?和N?O?）反應生成會生成亞硝基化合物。
國際癌癥研究機構(IARC)根據(jù)大量研究數(shù)據(jù)，將多種亞硝基化合物列為2A類或2B類致癌物（即可能或潛在的致癌物）。國際協(xié)調委員會(ICH)M7指南也將其列為“關注物質群”。
圖1：常見亞硝基化合物種類及結構特征
近年來，亞硝基化合物（尤其是亞硝胺）引起了全球制藥工業(yè)及監(jiān)管機構的高度關注。這一現(xiàn)象的起因是血管緊張素II受體拮抗劑（ARB類藥物，如纈沙坦、氯沙坦、厄貝沙坦和奧美沙坦）中檢測出微量的N-亞硝基二甲胺(NDMA)。2019年，二甲雙胍和雷尼替丁中也檢測出了NDMA。自此，因檢測到其他類型亞硝胺雜質而導致的藥品召回事件屢見不鮮，例如利福平、利福噴丁、伐尼克蘭、喹那普利和氫氯噻嗪等藥物。全球各地的監(jiān)管機構發(fā)布了多項指南文件和建議，以應對藥品中亞硝胺雜質的風險。
值得注意的是由于實際工作中由于亞硝胺(Nitrosamines)的數(shù)量遠遠大于亞硝酰胺(Nitrosamides)，所以導致很多時候“亞硝胺”和“亞硝酰胺”這兩類化合物之間的界限被模糊化，導致研發(fā)人員在風險評估中錯誤地將亞硝酰胺等同于亞硝胺，并采用錯誤的研究方法。但是如果仔細研讀官方文件就可以發(fā)現(xiàn)，在監(jiān)管指南中往往會使用更為準確的詞匯Nitros-來表示“亞硝基類”化合物風險。
從有機化學角度而言，亞硝酰胺（如酰胺、N-烷基尿素、胍類或氨基甲酸酯的亞硝基衍生物）與胺類的亞硝基衍生物（即亞硝胺）在結構和性質上截然不同。亞硝酰胺的化學反應活性較高，可直接與親核底物和自由基等物質發(fā)生作用，無需通過代謝活化即可表現(xiàn)出誘變性或致癌性。但是大部分的亞硝酰胺由于化學反應活性很高，即使產生也會很快降解成為其他雜質甚至無法分離；然而作為對比，亞硝胺化學穩(wěn)定性良好，未經(jīng)代謝的亞硝胺不易于生物分子或其他化學分子發(fā)生相互作用，將會在藥物中穩(wěn)定存在，直至經(jīng)由代謝活化才能發(fā)揮作用。因此，這兩類化合物不應被混為一談(Pharmaceutical Technology, Trends in Formulation, 2022 eBook, 42–50.)。
亞硝胺和亞硝酰胺是亞硝基化合物主要兩類結構。亞硝胺由次級或三級胺與亞硝酸鹽或其他亞硝基化試劑反應生成，其化學結構可被視為亞硝酸的“胺類衍生物”。其代謝主要依賴于細胞色素P450催化的α-羥基化作用，產生帶正電的電親化物，從而對DNA進行烷基化損傷（圖2）。因此，在體外環(huán)境中亞硝胺通常較為穩(wěn)定，廣泛存在于環(huán)境和藥品中，亞硝胺的致癌性需要通過代謝活化后才能體現(xiàn)。
圖2：亞硝胺和亞硝酰胺等亞硝基化合物可誘變化合物代謝途徑
相比之下，亞硝酰胺（如N-亞硝酰胺、N-亞硝基氨基甲酸酯、N-亞硝基尿素和N-亞硝基胍類化合物）在化學結構及活化機制上與亞硝胺顯著不同。亞硝酰胺的結構中，亞硝基(-NO)與羰基(C=O或C=N)的協(xié)同作用，使其無需代謝活化即可直接生成電親化物。這種直接作用模式，使亞硝酰胺具有比亞硝胺更高的誘變性，但同時也帶來了顯著的化學不穩(wěn)定性。
雖然我們可以看到一些亞硝酰胺化合物（如卡莫司汀和洛莫司?。┍憩F(xiàn)出抗癌潛力，并被用作抗腫瘤藥物的活性成分，但對于大部分的亞硝酰胺在藥品生產或儲存條件下下穩(wěn)定性較差，會和水分子等親核試劑發(fā)生快速的降解（圖3，ACS Symposium Series, 1993, 553 , 1-18.）。
圖3：亞硝酰胺和水分子的反應
亞硝酰胺即使在未加任何外源性試劑條件下自身也有可能發(fā)生快速的分解反應。參考Julius Rebek Jr.和Fahmi Himo 等研究人員結果（參考文獻：Tetr Lett 2011, 52, 2100-2103; J. Org. Chem. 2019, 84, 7354-7361）顯示N-丁基-4-甲基-N-亞硝基苯甲酰胺在35℃條件下該亞硝酰胺化合物會在一天內大量分解，直至67小時后完全分解為對應酯基化合物。如果是一級酰胺的亞硝基衍生物甚至會得到降解為對應羧酸的產物(J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14115–14126.)。實驗表明，該降解路徑在常見儲存條件下廣泛存在，凸顯了亞硝酰胺的不穩(wěn)定性。
圖4：N-丁基-4-甲基-N-亞硝基苯甲酰胺自身降解反應監(jiān)測
此外受到環(huán)境中光照或酸堿等影響也可能發(fā)生其他降解反應(Can. J. Chem. 1969, 47, 2441–2448)，例如在光照條件下亞硝酰胺可能很快發(fā)生分解產生酰胺或重排產物，該反應在室溫條件下可在數(shù)小時內完成，類似的降解反應也會發(fā)生在亞硝基磺酰胺結構中(Recl. Trav. Chim. Pays‐Bas 1971, 90, 901–905.)。
圖5：亞硝酰胺分解產物
這些降解反應可以參考以下反應機理。
圖6：亞硝酰胺自身降解反應機理
鑒于亞硝胺與亞硝酰胺在活化機制、穩(wěn)定性及毒理效應方面的顯著差異，兩者不應在風險評估中被等同對待。大部分情況下即使有產生亞硝酰胺雜質的風險，但是對應的亞硝酰胺在物料中往往無法穩(wěn)定存在，會在極短的時間內降解為其他雜質。因此對于亞硝酰胺的風險評估，首先應考慮該原料藥或相關物質的亞硝酰胺雜質是否在物料中穩(wěn)定存在，然后再選擇合理的方法進行定性定量測試。
同時我們也應注意到，越來越多的各國監(jiān)管機構在指導文件中也開始明確區(qū)分亞硝胺和亞硝酰胺的風險，以避免在評估或監(jiān)管中出現(xiàn)混淆。
