小伙伴們?cè)诮o貼壁細(xì)胞傳代的時(shí)候有沒有遇到細(xì)胞消化不下來的情況呢？有時(shí)候等了10分鐘甚至20分鐘細(xì)胞仍巋然不動(dòng)，繼續(xù)等待怕消化過度，暴力吹下又怕對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，可謂進(jìn)退兩難。
小尚為大家總結(jié)了細(xì)胞難消化的原因，以及對(duì)應(yīng)的處理方式：
（本文僅針對(duì)胰蛋白酶，若您使用其他類型的細(xì)胞解離試劑，可以在評(píng)論區(qū)留言）
- 細(xì)胞貼壁緊
不同種類的細(xì)胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細(xì)胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來的程度。而MCF10A細(xì)胞卻貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養(yǎng)一株細(xì)胞之前，可以問問有經(jīng)驗(yàn)的師哥師姐或者上網(wǎng)查資料確認(rèn)這株細(xì)胞大概消化多久，做到知己知彼百戰(zhàn)百勝。
解決方案：若您培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁較緊，可以增加消化時(shí)間或胰酶的濃度；加入足量的胰酶至沒過細(xì)胞；37℃消化；使用含有EDTA的胰酶。
小技巧：
在消化貼壁較緊的細(xì)胞有個(gè)小技巧，就是消化到細(xì)胞要脫落的時(shí)候先不終止，先吸胰酶輕輕吹下細(xì)胞，大部分細(xì)胞脫落后再加終止液。貼壁太強(qiáng)的細(xì)胞，先加終止有時(shí)候會(huì)很快貼壁回去導(dǎo)致消化其實(shí)細(xì)胞已經(jīng)要脫落了，但一加終止液就貼回去的情況。
- 有殘留血清
血清中的某些蛋白質(zhì)（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對(duì)蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹底，胰酶將不能發(fā)揮作用。
解決方案：若在消化途中發(fā)現(xiàn)因潤(rùn)洗不徹底而無法消化下來，吸去培養(yǎng)器皿中的胰酶（如果已有部分細(xì)胞脫落，將已脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管），向培養(yǎng)器皿中加入足量PBS重新潤(rùn)洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶重新消化。
- 胰酶量過少/濃度低/消化溫度低
有的小伙伴習(xí)慣用胰酶潤(rùn)洗細(xì)胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續(xù)消化，這對(duì)于貼壁松的細(xì)胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細(xì)胞。胰酶量太少無法將貼壁緊的細(xì)胞消化徹底。
胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當(dāng)溫度低于37℃時(shí)胰酶活性低，室溫環(huán)境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進(jìn)度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細(xì)胞，對(duì)于貼壁緊的細(xì)胞室溫下是很難消化下來的，甚至可能因消化時(shí)間過長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。
常見的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規(guī)細(xì)胞系多用0.25%胰酶，而對(duì)胰酶敏感的較脆弱的細(xì)胞可使用0.125%胰酶消化。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。
解決方案：根據(jù)細(xì)胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。
- 胰酶失活
胰酶開封久了活性會(huì)降低甚至徹底失活，所以小伙伴們可以根據(jù)需要將開封的胰酶分裝到離心管中，將暫時(shí)不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。
解決方案：若發(fā)現(xiàn)胰酶開封太久，建議使用新的胰酶進(jìn)行消化。
- 胰酶品牌差異
胰酶通常來自牛或豬的胰腺，不同廠家的提取加工工藝不同，所生產(chǎn)的胰酶消化時(shí)間差別較大。
解決方案：從不同廠家獲取胰酶試用裝，找到最適合自己細(xì)胞的胰酶品牌。
- 細(xì)胞密度過大或長(zhǎng)時(shí)間不傳代
細(xì)胞密度過大，造成細(xì)胞擁擠或者堆疊時(shí)細(xì)胞將變得更難消化。另外，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)不傳代也有可能使細(xì)胞貼壁變緊。
解決方案：若出現(xiàn)上述情況，可增加胰酶的用量，并適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，直到細(xì)胞能夠脫落。