--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱： NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細(xì)胞)

細(xì)胞別稱： NK-92MI MI; NK-92MI mi; NK92-MI; NK92MI; NK-92MI transfected with MFG-Hil2

細(xì)胞貨號(hào)： SNL-195

生長(zhǎng)特性： 懸浮

培養(yǎng)條件： 1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細(xì)胞簡(jiǎn)介： NK-92細(xì)胞是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來(lái)的一株IL-2依賴型NK細(xì)胞株。NK-92MI細(xì)胞是轉(zhuǎn)染得到的源自NK-92細(xì)胞的IL-2非依賴的NK細(xì)胞株，親本細(xì)胞NK-92通過(guò)微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可能由于載體整合到基因組DNA中，轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的。NK-92MI細(xì)胞細(xì)胞對(duì)很多惡性細(xì)胞有細(xì)胞毒性；鉻釋放試驗(yàn)顯示它能殺死K562細(xì)胞和Daudi細(xì)胞。NK-92細(xì)胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標(biāo)記陽(yáng)性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標(biāo)記陰性。NK-92MI細(xì)胞和NK-92CI細(xì)胞這兩個(gè)變種都包含、表達(dá)并合成hIL-2cDNA。NK-92MI細(xì)胞合成的IL-2水平比NK-92CI高，而親本細(xì)胞不合成表達(dá)。1998年9月提交到ATCC的培養(yǎng)物污染了支原體，其后代通過(guò)BM細(xì)胞周期蛋白處理21天消除支原體，處理后6周，用Hoechst染色、PCR和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)測(cè)試進(jìn)行支原體檢測(cè)，結(jié)果都呈陰性。

細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)照片

NK-92MI細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

50. NK-92MI細(xì)胞呈聚團(tuán)懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)較大時(shí)需要吹打成小團(tuán)，防止團(tuán)塊中間的細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。除非實(shí)驗(yàn)需要，不建議經(jīng)常將細(xì)胞吹散成單個(gè)細(xì)胞，否則細(xì)胞狀態(tài)將變差；
50. NK-92MI細(xì)胞對(duì)血清要求高，應(yīng)該使用優(yōu)質(zhì)血清進(jìn)行培養(yǎng)；
50. NK-92MI細(xì)胞對(duì)吹打等機(jī)械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度輕柔；
50. NK-92MI細(xì)胞對(duì)溫度敏感，培養(yǎng)基、PBS需復(fù)溫至37℃再使用。
50. NK-92MI細(xì)胞凍存難度較大，建議使用90% FBS+10%DMSO凍存液，凍存密度推薦300萬(wàn)細(xì)胞/毫升，不能過(guò)低。凍存時(shí)細(xì)胞應(yīng)吹散成單細(xì)胞。
50. 復(fù)蘇時(shí)建議將血清濃度提高至20%，待細(xì)胞可以正常聚集生長(zhǎng)后再將血清濃度恢復(fù)至10%
50. NK-92MI細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)算得的細(xì)胞的活率不能代表該細(xì)胞真實(shí)的狀態(tài)。因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)存在一些散在的單細(xì)胞，這些細(xì)胞活性較低，且不能完全去除，導(dǎo)致在計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞整體活率可能不高。細(xì)胞狀態(tài)可以通過(guò)細(xì)胞能否聚團(tuán)判斷：只要大部分細(xì)胞能聚團(tuán)生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)就沒(méi)有問(wèn)題。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)，細(xì)胞無(wú)法順利聚團(tuán)。
50. 當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時(shí)，向培養(yǎng)基中按100-200U/mL補(bǔ)充IL-2，可有效改善。

NK-92MI細(xì)胞換液方法

50. 半換液法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無(wú)菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時(shí)間，待細(xì)胞沉底；（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況）
3. 吸頭緊貼液面，小心吸出一半的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到離心管；
4. 900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細(xì)胞，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶；
5. 原瓶補(bǔ)充一半的新鮮培養(yǎng)基。

Tips：建議半換液2-3次后進(jìn)行離心換液。

50. 離心換液法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無(wú)菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
2. 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；
3. 900-1000rpm，3min離心；
4. 棄上清，加5mL PBS輕輕重懸細(xì)胞進(jìn)行潤(rùn)洗，再900-1000rpm，3min離心；

Tips：此處PBS潤(rùn)洗是為了去除細(xì)胞碎片，平時(shí)培養(yǎng)若細(xì)胞碎片不多可以忽略此步驟。

5. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；
6. 離心完成后棄上清，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中，混勻細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

NK-92MI細(xì)胞傳代方法

50. 離心法：

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無(wú)菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；
3. 900-1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；
4. 在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）
5. 離心完成后，棄離心管內(nèi)上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基，輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

50. 直接分瓶法：

1. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分散；若有較大的細(xì)胞團(tuán)，需吹散成小團(tuán)。
2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞懸液，均分到若干個(gè)新培養(yǎng)瓶中，每瓶再補(bǔ)充適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：

50. 注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時(shí)間不要過(guò)高，避免細(xì)胞受機(jī)械損傷。
50. 傳代比例推薦1：2

NK-92MI細(xì)胞凍存方法

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無(wú)菌槍頭等；（試劑需提前預(yù)熱）

Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃，先換液靜置培養(yǎng)4h左右，待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存。

2. 根據(jù)收集到細(xì)胞量，配制相應(yīng)量的凍存液，并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管，在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱，代次，凍存時(shí)間等信息。推薦凍存液配方：90%FBS+10%DMSO；凍存密度300萬(wàn)細(xì)胞/mL/管。

Tips：凍存密度過(guò)低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳。

3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；
4. 離心完成后棄上清，加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產(chǎn)生過(guò)多氣泡；

Tips：加入凍存液混勻細(xì)胞后及時(shí)分裝并將細(xì)胞降溫凍存，以減少DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性。

5. 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。
6. 次日（16h-24h后）復(fù)蘇一管檢查凍存效果，確認(rèn)沒(méi)問(wèn)題后及時(shí)將凍存細(xì)胞放置液氮中保存，細(xì)胞在-80℃冰箱放置時(shí)間不要超過(guò)3天。

NK-92MI細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
2. 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完全融化，融化時(shí)間不超過(guò)2min；

Tips：

50. 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

50. 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時(shí)在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；
4. 離心完成后棄上清，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基（建議血清濃度提高至20%）輕輕重懸細(xì)胞，吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中；
5. 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips：整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

NK-92MI細(xì)胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒，確認(rèn)細(xì)胞，說(shuō)明書(shū)等是否齊全，收貨細(xì)胞名與所購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞是否符合；
2. 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好，有無(wú)漏液，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見(jiàn)的絮狀物或者渾濁等，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；
3. 確認(rèn)無(wú)異常后，將培養(yǎng)瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右，讓?xiě)腋〖?xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部；
4. 平衡過(guò)程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項(xiàng)等；
5. 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，此時(shí)大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞；
6. 將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞，上清可以4℃保存，后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞，以平穩(wěn)過(guò)度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶；
7. 觀察細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，以及團(tuán)塊數(shù)量、大小決定傳代或繼續(xù)培養(yǎng)。

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過(guò)900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，不建議頻繁離心。

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