背景[1-6]
酵母RNA分離是用TransZol Up裂解樣品，加入氯仿后，溶液分為無(wú)色水相和粉紅色有機(jī)相，RNA在水相中；用硅膠膜離心柱特異吸附水相中的RNA，與其它總RNA提取方法相比，既具有TransZol Up裂解能力強(qiáng)、提取量高，應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。酵母是一種具有特殊細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的真菌，其細(xì)胞壁是由內(nèi)層葡聚糖的細(xì)纖維，覆蓋在細(xì)纖維上面的中間層糖蛋白和外層甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯鍵共價(jià)連接，形成復(fù)雜的，緊密交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與細(xì)菌細(xì)胞壁一樣，酵母細(xì)胞壁比其它種類的細(xì)胞壁都相對(duì)會(huì)厚，并且交聯(lián)又緊密，所以這就給RNA的提取純化工作帶來(lái)很大困難。
目前，市場(chǎng)中酵母RNA提取的產(chǎn)品均很難對(duì)酵母細(xì)胞壁進(jìn)行有效地破碎，TRIZOL主要成份是異硫氰酸胍和苯酚，沒(méi)有有效破壁的成分，提取的酵母總RNA利用電泳分析只具有5s rRNA，很顯然不完整；玻璃珠型的不是破碎不充分，得率低，就是破碎太劇烈片段斷裂，很難掌控；而利用傳統(tǒng)的苯酚法提取，要經(jīng)過(guò)組織勻漿，苯酚處理而后乙醇沉淀等一些列步驟，雖然最后能得到生物活性的RNA。但步驟復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)且不利于多個(gè)樣品同時(shí)操作，也并非理想的提取方法。后來(lái)有些公司雖然對(duì)以上方法又作出了改進(jìn)，但提取效果仍不是很理想。
酵母菌是一些單細(xì)胞真菌，目前已知的酵母菌有1000多種。酵母菌有三類：子囊菌、擔(dān)子菌和“假酵母”。目前已知大部分酵母都屬于子囊菌門，這是一種產(chǎn)生孢子的菌。酵母菌主要生長(zhǎng)在潮濕或液態(tài)環(huán)境，有些也會(huì)生存在生物體內(nèi)。目前，尤其是食品行業(yè)中，酵母菌顯得異常興盛，比如啤酒發(fā)酵，酸奶污染等都與酵母息息相關(guān)。所以，科研人員對(duì)酵母菌的研究工作也是越來(lái)越熱。
總RNA提取的純度與完整性，對(duì)于許多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展都至關(guān)重要，比如，Northern印跡及雜交分析，cDNA文庫(kù)構(gòu)建等，這些實(shí)驗(yàn)的成敗在很大程度上取決于總RNA的提取質(zhì)量。對(duì)于RNA含量豐富，易于破碎的樣品來(lái)說(shuō)，高質(zhì)量RNA的提取并非難事，但對(duì)于破壁較為困難的材料——酵母來(lái)說(shuō)，就并非人人都能很好地提取出高質(zhì)量的RNA。
應(yīng)用[7][8]
可用于樹干畢赤酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST序列測(cè)定：
將植物纖維水解液中30%左右的木糖有效利用轉(zhuǎn)化為酒精是降低酒精生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。樹干畢赤酵母是研究得最多、最具工業(yè)應(yīng)用前景的木糖發(fā)酵酵母,目前對(duì)于樹干畢赤酵母木糖代謝的生理學(xué)機(jī)制還知之甚少。以cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)的EST（Expressed Sequence Tag,表達(dá)序列標(biāo)簽）技術(shù)是一種快速的進(jìn)行基因功能分析及發(fā)現(xiàn)新基因的有效方法。
以約900mg（干重）酵母為材料提取獲得了約1.2mg總RNA,提取得率達(dá)到1.3‰,提取出的RNA具備完整性,質(zhì)量高,是cDNA文庫(kù)構(gòu)建的良好材料。以提取出的RNA為材料,純化出mRNA（messager RNA,信使RNA）,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄出cDNA鏈,以置換合成法合成cDNA雙鏈,通過(guò)膠純化回收的方法篩選出其中大于500bp的片段與載體連接,最后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌,構(gòu)建出樹干畢赤酵母P5776的cDNA文庫(kù),經(jīng)質(zhì)量檢測(cè),初級(jí)文庫(kù)滴度達(dá)到1.0×106pfu（plaque forming units,噬菌斑形成單位）/mL,擴(kuò)增文庫(kù)總克隆數(shù)達(dá)到1.25×109,文庫(kù)中71%的重組子插入片段大于300bp,達(dá)到cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求,完全可以用于大規(guī)模EST序列測(cè)定及數(shù)據(jù)分析。
參考文獻(xiàn)
[1]Adaptive response of yeasts to furfural and 5-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bis-hydroxymethylfuran[J].Z.L.Liu,P.J.Slininger,B.S.Dien,M.A.Berhow,C.P.Kurtzman,S.W.Gorsich.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2004(8)
[2]Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass[J].H.B.Klinke,A.B.Thomsen,B.K.Ahring.Applied Microbiology and Biotechnology.2004(1)
[3]Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts[J].T.W.Jeffries,Y.-S.Jin.Applied Microbiology and Biotechnology.2004(5)
[4]Two different pathways for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactate in mixed-acid fermentation by the lactic acid bacterium Lactococcus lactis IO-1[J].K.Tanaka,A.Komiyama,K.Sonomoto,A.Ishizaki,S.Hall,P.Stanbury.Applied Microbiology and Biotechnology.2002(1-2)
[5]On-line estimation of sugar concentration for control of fed-batch fermentation of lignocellulosic hydrolyzates by Saccharomyces cerevisiae[J].A.Nilsson,M.Taherzadeh,G.Lidén.Bioprocess and Biosystems Engineering.2002(3)
[6]Fermentation performance and intracellular metabolite patterns in laboratory and industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae[J].J.Zaldivar,A.Borges,B.Johansson,H.Smits,S.Villas-B?as,J.Nielsen,L.Olsson.Applied Microbiology and Biotechnology.2002(4-5)
[7]Iogen’s process for producing ethanol from cellulosic biomass[J].Jeffrey S.Tolan.Clean Technologies and Environmental Policy.2002(4)
[8]范一民.樹干畢赤酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST序列測(cè)定[D].南京林業(yè)大學(xué),2005.