背景^[1-6]

組織總RNA小量提取試劑盒用于動物組織，細胞，老鼠尾巴，石蠟包埋組織基因組DNA提取，硅膠膜純化技術(shù)，限度去除蛋白質(zhì)，多糖，脂類等雜質(zhì)，純度高，整個提取過程無需乙醇沉淀和酚/氯仿抽提。組織總RNA小量提取試劑盒可從多種細胞和組織中快速進行總RNA柱式純化。小于20分鐘的高質(zhì)量RNA；從單一的提取物中純化高達1,000微克的RNA；無害組織（酚/氯仿）提取液裂解。使用組織總RNA小量提取試劑盒分離獲得的總RNA可用于需要高質(zhì)量的總RNA的多種下游應(yīng)用領(lǐng)域。

操作步驟：

1.將組織在液氮中磨碎成粉沫。每20~30mg組織加600ulBufferRL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20mg加350ulBufferRL。樣品體積不超過BufferRL體積的十分之一。

2.樣品充分裂解后，室溫放置5min，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。

3.12000rpm離心2~5min，取上清進行下步操作。

4.加入1倍體積（600ul或350ul）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。

5.將步驟4所得溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnCR）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉(zhuǎn)入，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

6.向吸附柱中加入350μlBufferRD，10000rpm離心15sec，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.配制DNaseI混合液：取52ulDEPC-H2O，向其中加入8ul10×DNaseIBuffer和20ulDNaseI（1U/ul），混勻，配制成終體積為80ul的DNaseI混合液。

8.向吸附柱中直接加入80ulDNaseI混合液，20~30℃孵育15min。

9.向吸附柱中加入350ulBufferRD，10000rpm離心15sec，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入500ulBufferRW，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

11.重復(fù)步驟10。

12.12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。

13.將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入30~50ulDEPC-H2O，室溫放置1min，12000rpm離心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

應(yīng)用^[7][8]

可用于奶牛乳腺組織中miRNA表達譜研究以及與泌乳相關(guān)miRNA的鑒定：

miRNA是一類長約22個核苷酸(nt)的小分子非編碼RNA,它能使nRNA降解或蛋白翻譯抑制而起調(diào)控基因的作用,目前在生命活動的各個過程中都有相關(guān)niRNA的報道。奶牛乳腺泌乳是一個重要的生理過程,但是關(guān)于miRNA對其調(diào)控的研究卻不多。本研究采用Solexa高通量測序技術(shù)獲得奶牛乳腺泌乳期和非泌乳的niRNA序列,用基因芯片和real-time PCR方法分析泌乳期和非泌乳期miRNA的表達差異。

采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測這些miRNA可能的靶基因,構(gòu)建以泌乳為中心的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。最后研究了miR-484通過己糖激酶對糖代謝過程的調(diào)控。主要研究結(jié)果如下：

1、奶牛乳腺組織中niRNA的高通量測序為了獲得奶牛乳腺組織中的miRNA,分別構(gòu)建奶牛泌乳期與非泌乳期乳腺組織RNA文庫,用Solexa高通量測序技術(shù)分別測序,共獲得15,089,573條與18,079,366條原始讀數(shù),過濾低質(zhì)量、重復(fù)等序列后有11,964,909條與15,968,116條純凈序列用于后續(xù)分析。分析其長度分布,發(fā)現(xiàn)有超過一半的純凈序列在22nt,證明測序可靠。

2、奶牛乳腺組織miRNA的鑒定和特征分析本部分主要是對獲得的測序序列進行整理、歸類和分析,挖掘miRNA的特征。對得到的純凈序列進行比對分類,共發(fā)現(xiàn)有885條pre-miRNA編碼921條成熟體niRNA,在這些成熟體中有884條是唯一序列。這些唯一序列中有283條已知miRNA,96條與其他物種同源的miRNA,還有505條新發(fā)現(xiàn)的miRNA是。同時還分析了885條pre-miRNA在?；蚪M上的定位,共有800條pre-miRNA能與牛基因組比對上,其中230條pre-miRNA能組成55個基因簇。

3、泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺中miRNA表達差異譜分析及功能預(yù)測本部分主要研究泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺組織中miRNA表達差異,并對已知miRNA進行靶基因預(yù)測,最終構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

參考文獻

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[8]李真.奶牛乳腺組織中miRNA表達譜研究以及與泌乳相關(guān)miRNA的鑒定[D].浙江大學(xué),2012.