背景^[1-3]

DNAzol Reagent是一種即用型有機試劑，專門用于在約30分鐘內從全血中分離基因組DNA。DNAzol Reagent是一種完全的、可直接使用的基因組DNA提取試劑，簡單高效，結果可靠，可快速提取基因組DNA，適用于多種大量或少量樣品。DNAzol可在一個步驟中裂解細胞并水解RNA，經過乙醇沉淀后即可快速得到基因組DNA。整個過程只需10-30分鐘，DNA回收率可達70-100％，得到的DNA不需再純化，可直接用于Southern雜交、斑點雜交、分子克隆、PCR反應和其他分子生物學應用。

特點：

1.專門用于從全血中提取基因組DNA

2.優(yōu)化用于快速分離基因

DNAzol Reagent專門用于從全血中分離基因組DNA。DNAzol Reagent基于使用新型胍-去污劑裂解液，該溶液可水解RNA并允許從裂解液中選擇性沉淀DNA?？梢允褂?mlDNAzol Reagent從0.5 ml全血中分離基因組DNA，得到10-20μgDNA。除了分離基因組DNA外，DNAzol Reagent還可用于分離全血中的凋亡片段和血清中的病毒DNA。

DNAzol Reagent在其隔離協(xié)議中結合了可靠性，效率和簡單性。在該過程中，將血液樣品與DNAzol試劑混合，并用異丙醇從所得裂解物中沉淀DNA。然后依次用DNAzol試劑洗滌DNA沉淀，接著用乙醇洗滌，然后溶解。整個過程可在約30分鐘內完成。

操作步驟：

1.裂解，勻漿：

a.組織：25-50mg組織加1ml DNAzol，使用勻漿儀處理5-10次。少量（5-10mg）柔軟組織，如脾或腦組織，可切成或者搗成小塊使用微量取樣器吹打混勻，室溫放置5-10分鐘。

b.細胞：單層培養(yǎng)的細胞應直接裂解，倒出培養(yǎng)基，加入DNAzol用取樣器吹打幾次混勻。每10cm2細胞培養(yǎng)板加0.75-1.0ml DNAzol。

c.細胞沉淀或懸浮液：每1-3×107細胞（體積小于0.1ml）加1ml DNAzol，反復吹打混勻。

以上均要使用大口徑槍頭吹打，以免過度剪切斷基因組。

2.離心：4-25℃，10000g離心10分鐘。將得到的上清轉入新管。此步驟去除組織碎片、部分水解的RNA和多糖。如果所提樣品為含較多細胞和細胞外物質的樣品，如肝、肌肉和大部分植物組織等，或要提取不含RNA的DNA時，可加此步驟。其他樣品可省略此步。

3.沉淀：每使用1ml DNAzol加0.5ml 100%乙醇，顛倒離心管5-8次，混勻樣品至出現(xiàn)DNA沉淀，室溫放置1-3分鐘?？梢钥匆奃NA絮狀沉淀，讓沉淀自然沉降到管底，盡可能吸棄上清。用槍頭攪繞DNA貼附在離心管上端壁上，仔細吸棄剩下的在管底和管壁的上清。如果因為剪切太厲害導致形成小片段或者量少的DNA(少于15ug)，無法纏繞到槍頭上，可在4-25℃，4000g離心1-2分鐘沉淀DNA，棄上清。

4.漂洗：用0.8-1ml 75％乙醇漂洗DNA兩次。漂洗時，將DNA懸浮在乙醇中，顛倒離心管3-6次，然后靜置0.5-1分鐘使DNA沉降到管底，盡可能吸棄上清。如果需要，可在4-25℃，1000g離心1-2分鐘沉淀DNA。從組織中提取DNA時，如需去除其他內含物，次漂洗可用70％DNAzol和30％乙醇的溶液代替75％乙醇。

5.溶解：用槍吸去殘余的乙醇，晾干幾秒鐘后立刻用8mM NaOH溶解DNA（DNA暴露于空氣幾秒鐘都會大大加大溶解難度，因此乙醇晾后立刻溶解）。可將沉淀吸到大口徑槍頭中緩慢通過數(shù)次來幫助溶解。TE緩沖液和水溶解效果不完全，因此建議用堿溶液，可更快速且徹底的溶解。

通常，從107細胞或10-20mg動物組織中提取的DNA可用0.2-0.3ml 8mM NaOH溶解，使DNA濃度約為0.2-0.3ug/ul。如果從植物、肝臟、肌肉等富含糖原的材料提取DNA，最后可能會有一些殘留物（多糖）無法溶解，可以用12,000Xg離心10分鐘去除。8mM NaOH容易被空氣氧化，應該用不超過6個月的2-4mol的NaOH儲存液，每月配制一次。

6.結果檢測：

以8mM NaOH溶液溶解的DNA（用DNAzol提取的DNA在Tris緩沖液中溶解效果不好）在紫外分光光度計檢測A260/A280，A260為1相當于50ug雙鏈DNA/ml。得到的A260/A280應為1.6-1.9，片段大小為20-100kb。得到的DNA片段大小取決于提取過程中機械外力對DNA的破壞程度.

應用^[4][5]

DNAzol試劑可用于全血基因組DNA的快速提?。?/p>

采用不完全溶血劑STMT處理全血樣品，異硫氰酸胍裂解白細胞核，硅膠特異性吸附釋放出來的DNA，漂洗液洗去硅膠上非DNA成分，最后用TE把DNA從硅膠上洗脫下來。對所建立的方法的實驗條件包括異硫氰酸胍(GuSCN)濃度、結合液pH值、結合溫度等進行優(yōu)化，從而得到高質量的DNA溶液，建立異硫氰酸胍-硅膠法。并對所建立的方法通過以下幾方面進行評價，包括DNA的產量、DNA的純度、DNA的完整性、RNA的污染、重復性，以及將純化產物應用于PCR反應和限制性內切酶消化，并與傳統(tǒng)的SDS-蛋白酶K/苯酚-氯仿(簡稱酚-仿)法進行比較。

結果：1、異硫氰酸胍(GuSCN)濃度、結合液pH值和結合溫度等影響異硫氰酸胍-硅膠法的提取效率。其條件是GuSCN濃度為4M、結合液pH值為6.5、結合溫度為37℃。2、異硫氰酸胍-硅膠法提取DNA平均含量(3.7μg/100μl全血)高于酚-仿法(2.99μg/100μl全血)(p＜0.05)，純度(OD260/OD280 1.78)與酚-仿法(OD260/OD280 1.76)無顯著差異(p＞0.05)；RNA污染試驗表明，該方法提取的DNA基本上無RNA污染；瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，該方法提取的DNA為大分子物質，在紫外吸收有典型的DNA紫外吸收峰。3、該方法重復性好，提取DNA的產量批內變異系數(shù)為6.02％，純度批內變異系數(shù)為6.74％。4、提取DNA適合于限制性酶切反應，PCR反應等。

結論：1、建立簡單、快速提取全血基因組DNA的異硫氰酸胍-硅膠法，整個提取過程費時小于40min。2、提取的DNA質量高、純度好，適用于大多數(shù)分子生物學實驗，如PCR、限制性酶切反應等。3、費用低，無需貴重試劑和特殊儀器，易于臨床實驗室大規(guī)模使用。

參考文獻

[1]Maternal serum cell-free fetal DNA levels are increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18[J].Tuangsit Wataganara,Erik S.LeShane,Antonio Farina,Geralyn M.Messerlian,Thomas Lee,Jacob A.Canick,Diana W.Bianchi.Human Genetics.2003(2)

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[3]DNA isolation by a rapid method from human blood samples:Effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Debomoy K.Lahiri,Bill Schnabel.Biochemical Genetics.1993(7)

[4]介紹一種簡便快速的可供臨床實驗室使用的DNA提取、純化方法[J].秦秋平.生命的化學(中國生物化學會通訊).1991(03)

[5]羅心靜.全血基因組DNA的快速提取及其應用[D].中南大學,2003.