背景[1-5]
PureLink HiPure質(zhì)粒過濾大提試劑盒設(shè)計用于從25至500 ml菌液中分離最高純度的質(zhì)粒DNA。PureLink™HiPure過濾法質(zhì)粒提取試劑盒(PureLink™HiPure Plasmid Filter Kit)包括HiPure過濾柱，將細菌裂解液澄清過濾與質(zhì)粒DNA陰離子交換樹脂純化整合到一個單元。所得質(zhì)粒DNA的質(zhì)量相當于進行了兩次氯化銫梯度離心，后者是最嚴格的DNA純化方法。不到兩小時即可純化出適于轉(zhuǎn)染和其它應(yīng)用的高質(zhì)量DNA，無需通過額外步驟去除污染物，如RNA、蛋白或內(nèi)毒素。另外，方案中去除了酚、氯仿、溴化乙錠和氯化銫，因而程度減少了有害物質(zhì)的接觸和處理。
PureLink HiPure質(zhì)粒過濾大提試劑盒特點：
•簡單的方案-無需離心就可澄清細菌裂解液；
•快速獲得結(jié)果-不到兩小時就可完成質(zhì)粒DNA的純化，節(jié)省時間；
•高產(chǎn)量-中量提取產(chǎn)量高達200µg，大量提取產(chǎn)量高達850µg；
•可靠的性能-使用這些試劑盒純化的高質(zhì)量質(zhì)粒DNA適用于多種應(yīng)用。
工作原理：
PureLink HiPure質(zhì)粒過濾大提試劑盒的HiPure過濾柱，無需離心即可快速澄清細菌裂解液。裂解液過濾筒整合到了DNA結(jié)合柱，在同一個步驟中，既能澄清裂解液，又可使質(zhì)粒DNA直接結(jié)合到陰離子交換樹脂上。單次柱洗滌即可去除雜質(zhì)，例如：RNA、蛋白質(zhì)、代謝物和其它低分子量分子，超純質(zhì)粒DNA用高鹽緩沖液洗脫。然后進行異丙醇沉淀步驟，脫鹽和濃縮DNA，再通過離心的方法回收DNA。整個方案可在約兩小時內(nèi)完成。
應(yīng)用[6][7]
PureLink HiPure質(zhì)粒過濾大提試劑盒用于乙型肝炎病毒全基因質(zhì)粒在SV40T永生化小鼠肝細胞中的表達：
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是嗜肝DNA病毒屬的一員。HBV可以引起肝臟的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起嚴重肝臟疾病的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全球20多億人曾感染乙肝病毒,其中3.5億以上為慢性乙型肝炎病毒感染者。
乙型肝炎的治療取決于幾個因素,如疾病的階段,“e”抗原的存在或缺失、耐藥性、特別是在肝臟慢性疾病的終末期后期無有效藥物治療。因此,在治療時機的選擇及治療過程中對以上因素的評價是非常重要的。將SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因?qū)爰毎麅?nèi)是最常用的細胞永生化的方法,幾乎適用于各種人類細胞類型。通過對SV40T基因介導的永生化細胞系的深入研究,多數(shù)研究結(jié)果顯示SV40T基因的導入除提高轉(zhuǎn)化細胞的生長速率外,能保留其原始細胞的許多分化表型,而非原始基因的表達很少見,在細胞水平上可反映其原始細胞的生物學特性,可作為體外研究的模型。
1.3拷貝HBVDNA質(zhì)粒含HBV完整復(fù)制體,基因組小于2.0拷貝,且復(fù)制和表達效率高于1.2和1.1拷貝,包含了HBV5’末端EnhⅠ、EnhⅡ,復(fù)制起始區(qū)(DR1、DR2)、前基因組轉(zhuǎn)錄起始位點x和前C區(qū)啟動子,x開放讀碼框等,所以應(yīng)用的最多。經(jīng)SV40T抗原轉(zhuǎn)染的小鼠肝細胞系可以被pHBV1.3質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后HBV可以在SV40T抗原轉(zhuǎn)染的永生化小鼠肝細胞內(nèi)進行病毒基因的復(fù)制,形成病毒復(fù)制中間體。并且進一步進行病毒基因的表達,合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg;pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后永生化小鼠肝細胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細胞。
總結(jié)：本研究結(jié)果證實,pRSV-T質(zhì)?？梢允剐∈蟾渭毎郎?建立SV40T永生化小鼠肝細胞系。SV40T永生化小鼠肝細胞系具有原代小鼠肝細胞形態(tài)和生長特性,且在體外可以傳代培養(yǎng)。且可以被pHBVl.3質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原轉(zhuǎn)染的永生化小鼠肝細胞內(nèi)進行病毒基因的復(fù)制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒復(fù)制中間體,且進一步進行病毒基因的表達,合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后永生化小鼠肝細胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細胞。
參考文獻
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[7]宋修光.1.3倍乙型肝炎病毒全基因質(zhì)粒在SV40T永生化小鼠肝細胞中的表達[D].山東大學,2012.