背景[1-5]
PureLink HiPure質粒過濾大提試劑盒設計用于從25至500 ml菌液中分離最高純度的質粒DNA。PureLink™HiPure過濾法質粒提取試劑盒(PureLink™HiPure Plasmid Filter Kit)包括HiPure過濾柱，將細菌裂解液澄清過濾與質粒DNA陰離子交換樹脂純化整合到一個單元。所得質粒DNA的質量相當于進行了兩次氯化銫梯度離心，后者是最嚴格的DNA純化方法。不到兩小時即可純化出適于轉染和其它應用的高質量DNA，無需通過額外步驟去除污染物，如RNA、蛋白或內毒素。另外，方案中去除了酚、氯仿、溴化乙錠和氯化銫，因而程度減少了有害物質的接觸和處理。
PureLink HiPure質粒過濾大提試劑盒特點：
•簡單的方案-無需離心就可澄清細菌裂解液；
•快速獲得結果-不到兩小時就可完成質粒DNA的純化，節(jié)省時間；
•高產(chǎn)量-中量提取產(chǎn)量高達200µg，大量提取產(chǎn)量高達850µg；
•可靠的性能-使用這些試劑盒純化的高質量質粒DNA適用于多種應用。
工作原理：
PureLink HiPure質粒過濾大提試劑盒的HiPure過濾柱，無需離心即可快速澄清細菌裂解液。裂解液過濾筒整合到了DNA結合柱，在同一個步驟中，既能澄清裂解液，又可使質粒DNA直接結合到陰離子交換樹脂上。單次柱洗滌即可去除雜質，例如：RNA、蛋白質、代謝物和其它低分子量分子，超純質粒DNA用高鹽緩沖液洗脫。然后進行異丙醇沉淀步驟，脫鹽和濃縮DNA，再通過離心的方法回收DNA。整個方案可在約兩小時內完成。
應用[6][7]
PureLink HiPure質粒過濾大提試劑盒用于乙型肝炎病毒全基因質粒在SV40T永生化小鼠肝細胞中的表達：
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是嗜肝DNA病毒屬的一員。HBV可以引起肝臟的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起嚴重肝臟疾病的主要病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全球20多億人曾感染乙肝病毒,其中3.5億以上為慢性乙型肝炎病毒感染者。
乙型肝炎的治療取決于幾個因素,如疾病的階段,“e”抗原的存在或缺失、耐藥性、特別是在肝臟慢性疾病的終末期后期無有效藥物治療。因此,在治療時機的選擇及治療過程中對以上因素的評價是非常重要的。將SV40早期轉錄區(qū)基因導入細胞內是最常用的細胞永生化的方法,幾乎適用于各種人類細胞類型。通過對SV40T基因介導的永生化細胞系的深入研究,多數(shù)研究結果顯示SV40T基因的導入除提高轉化細胞的生長速率外,能保留其原始細胞的許多分化表型,而非原始基因的表達很少見,在細胞水平上可反映其原始細胞的生物學特性,可作為體外研究的模型。
1.3拷貝HBVDNA質粒含HBV完整復制體,基因組小于2.0拷貝,且復制和表達效率高于1.2和1.1拷貝,包含了HBV5’末端EnhⅠ、EnhⅡ,復制起始區(qū)(DR1、DR2)、前基因組轉錄起始位點x和前C區(qū)啟動子,x開放讀碼框等,所以應用的最多。經(jīng)SV40T抗原轉染的小鼠肝細胞系可以被pHBV1.3質粒二次轉染,轉染后HBV可以在SV40T抗原轉染的永生化小鼠肝細胞內進行病毒基因的復制,形成病毒復制中間體。并且進一步進行病毒基因的表達,合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg;pHBV1.3質粒轉染后永生化小鼠肝細胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細胞。
總結：本研究結果證實,pRSV-T質?？梢允剐∈蟾渭毎郎?建立SV40T永生化小鼠肝細胞系。SV40T永生化小鼠肝細胞系具有原代小鼠肝細胞形態(tài)和生長特性,且在體外可以傳代培養(yǎng)。且可以被pHBVl.3質粒二次轉染,轉染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原轉染的永生化小鼠肝細胞內進行病毒基因的復制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒復制中間體,且進一步進行病毒基因的表達,合成HBV特異性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3質粒轉染后永生化小鼠肝細胞能合成子代病毒顆粒并分泌出細胞。
參考文獻
[1]Neoplastic conversion of human colon smooth muscle cells:No requirement for telomerase[J].SitaiLiang,Morton S.Kahlenberg,Dennis L.Rousseau,Peter J.Hornsby.Mol.Carcinog..2008(6)
[2]A reversibly immortalized human hepatocyte cell line as a source of hepatocyte‐based biological support[J].NaoyaKobayashi,Karen A.Westerman,NoriakiTanaka,Ira J.Fox,PhilippeLeboulch.Addiction Biology.2006(4)
[3]Dynamic analysis of hepatitis B virus DNA and its antigens in 2.2.15 cells[J].M.‐C.Liu,M.Yu,N.‐L.Zhang,W.‐B.Gong,Y.Wang,W.‐H.Piao,Q.‐H.Wang,G.‐Q.Wang.Journal of Viral Hepatitis.2004(2)
[4]Peginterferonα‐2a(40?kDa):an advance in the treatment of hepatitis B e antigen‐positive chronic hepatitis B[J].W.G.E.Cooksley,T.Piratvisuth,S.‐D.Lee,V.Mahachai,Y.‐C.Chao,T.Tanwandee,A.Chutaputti,W.YuChang,F.E.Zahm,N.Pluck.Journal of Viral Hepatitis.2003(4)
[5]Primary human hepatocytes–a valuable tool for investigation of apoptosis and hepatitis B virus infection[J].Henning Schulze-Bergkamen,Andreas Untergasser,Andreas Dax,Heiko Vogel,Peter Büchler,Ernst Klar,Thomas Lehnert,Helmut Friess,Markus W Büchler,Michael Kirschfink,Wolfgang Stremmel,Peter H Krammer,Martina Müller,Ulrike Protzer.Journal of Hepatology.2003(6)
[6]In vitro antiviral susceptibility of full-length clinical hepatitis B virus isolates cloned with a novel expression vector[J].Huiling Yang,Christopher Westland,Shelly Xiong,William E Delaney.Antiviral Research.2003(1)
[7]宋修光.1.3倍乙型肝炎病毒全基因質粒在SV40T永生化小鼠肝細胞中的表達[D].山東大學,2012.