背景[1-5]
PureLink HiPure質(zhì)粒大提試劑盒使用新型專有、陰離子交換樹脂純化最高水平的轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒DNA。增強型樹脂結(jié)合大容量、快速流速、高分離度和高效內(nèi)毒素去除功能。質(zhì)粒分離通常在約90分鐘內(nèi)完成，純度等同于使用氯化銫（CsCl）梯度法分離獲得的純度。
PureLink HiPure Expi質(zhì)粒純化試劑盒提供超大量和宏量抽提，可以最快的流程獲得最高轉(zhuǎn)染級的質(zhì)粒DNA。PureLink HiPure Expi Plasmid試劑盒包括真空過濾柱，可在不離心的情況下進行細(xì)菌過濾，從而實現(xiàn)極快處理。
該試劑盒通常從500 mL細(xì)菌培養(yǎng)物中分離出4 mg高品質(zhì)超純質(zhì)粒DNA，固有內(nèi)毒素水平低。以簡單、快速、低成本的從大腸桿菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。該試劑盒結(jié)合了硅膠結(jié)合技術(shù)和離心柱形式的便利性，可在45分鐘內(nèi)從25-200 ml LB培養(yǎng)基中回收出多達1.2mg的質(zhì)粒DNA。請注意，實際得率和的培養(yǎng)物體積取決于質(zhì)粒和培養(yǎng)基。
PureLink HiPure質(zhì)粒大提試劑盒通過離心分離法收集過夜培養(yǎng)的重組大腸桿菌培養(yǎng)物，并通過改性SDS堿裂解法進行處理，之后再在高鹽環(huán)境下使DNA吸附到硅膠膜上。隨后通過離心洗滌步驟去除污染物。最后，在水或Tris-EDTA緩沖液中洗脫結(jié)合所得的DNA。
該試劑盒的優(yōu)勢包括：
1.高產(chǎn)量–單次純化1 L細(xì)菌培養(yǎng)物分離出超過5 mg的高品質(zhì)質(zhì)粒DNA
2純度–固有內(nèi)毒素水平低（通常為0.1-1.0 Eu/μg），A260/A280>1.8，尤其適用于哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染
3.簡單、快速–結(jié)合真空輔助方案，典型的質(zhì)粒分離僅需90分鐘即可完成
應(yīng)用[6][7]
PureLink HiPure質(zhì)粒大提試劑盒可用于抑制素對小鼠卵泡發(fā)育和精子發(fā)生的分子和細(xì)胞調(diào)控機制研究：
抑制素是由性腺所分泌的糖蛋白質(zhì)激素,與激活素一起調(diào)控垂體促卵泡素(FSH)合成和分泌,進而調(diào)控卵泡發(fā)育和精子發(fā)生,影響動物的生殖能力。本研究通過分析抑制素在波精子發(fā)生過程中的mRNA和蛋白的時空表達譜,研究了抑制素在精子發(fā)生中的作用,并以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid為載體,以抑制素α亞基基因(Inha)作為研究抑制素功能的候選基因,構(gòu)建了三對Inha RNAi重組質(zhì)粒,通過轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細(xì)胞和支持細(xì)胞,研究了抑制素對兩種細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控作用機制及與卵泡發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān)基因的表達作用,并用卵巢直接注射法研究了重組質(zhì)粒對卵巢組織作用研究。
為抑制素研究卵泡發(fā)育和精子發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ),并對人類生殖調(diào)控的研究有重要的借鑒作用,為以后開發(fā)促進精子發(fā)生、卵泡發(fā)育、提高超數(shù)排卵、人工孿生,轉(zhuǎn)基因動物的新技術(shù)有重要的指導(dǎo)意義。抑制素RNAi對體外培養(yǎng)小鼠睪丸支持細(xì)胞生長發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān)基因表達的作用構(gòu)建了pshRNA-1、pshRNA-2和pshRNA-3共3個Inha RNAi重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至支持細(xì)胞,應(yīng)用Real-Time PCR,Western blot分析了轉(zhuǎn)染48h后RNAi的效果,篩選出抑制效果干擾組,應(yīng)用Real-Time PCR,Western blot和流式細(xì)胞術(shù)研究抑制素對支持細(xì)胞細(xì)胞周期和精子發(fā)生相關(guān)基因表達的影響,發(fā)現(xiàn)：
(1)RNAi可顯著降低小鼠支持細(xì)胞目的基因的表達量,pshRNA-1、pshRNA-2、pshRNA-3均可顯著降低Inha的mRNA和蛋白表達水平,其中以pshRNA-2重組質(zhì)粒干擾效果最為顯著,對Inha mRNA的抑制率為58%；
(2)Inha RNAi后,小鼠支持細(xì)胞Inhba,Inhbb,Dhh和Tip1mRNA表達量上調(diào),Pdgfa和Kitl mRNA表達量下調(diào)；
(3)Inha RNAi后,小鼠支持細(xì)胞INHBA,INHBB和P21蛋白的表達量上調(diào)；CyclinD1 CyclinE蛋白的表達量下調(diào)；
(4)Inha RNAi后,S期的小鼠支持細(xì)胞比例顯著減少,G1期的小鼠支持細(xì)胞比例顯著增加；結(jié)果表明,抑制素通過調(diào)控支持細(xì)胞的細(xì)胞周期(G1至S期的過渡期),影響其生長發(fā)育,并且抑制素與支持細(xì)胞表達的與精子生成有關(guān)的基因Dhh,Tip1,Pdgfa和Kitl的表達有影響。
抑制素RNAi對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的生長發(fā)育調(diào)控作用及其機制研究用pshRNA-1、pshRNA-2和pshRNA-3共3個Inha RNAi重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞,應(yīng)用Real-Time PCR,Western blot分析了轉(zhuǎn)染48h后RNAi的效果,篩選出抑制效果干擾組,應(yīng)用Real-Time PCR,Western blot和流式細(xì)胞術(shù)研究抑制素對顆粒細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達的影響。
參考文獻
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