背景[1-6]
GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿性Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必須的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但是可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。
pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：Strep和gent。賦予GV3101菌株鏈霉素和慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)植物雙元pCambia2301M質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)103cfu/μg。-80℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
所謂的感受態(tài),就是指易于吸收外源DNA的狀態(tài),感受態(tài)細(xì)胞是指經(jīng)過(guò)處理（一般用CaCl溶液處理即可)后處于能夠吸收外源DNA的狀態(tài)的細(xì)胞.在基因工程中,當(dāng)受體細(xì)胞是植物時(shí),可以選用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,花粉管通道法和基因槍法；而受體細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞時(shí),一般選用顯微注射法；當(dāng)受體細(xì)胞是微生物時(shí),才用感受態(tài)的方法.所以質(zhì)粒也可以成為感受態(tài)細(xì)胞。
GV3101感受態(tài)細(xì)胞操作方法（采用凍融法）：
1.取-80℃保存的GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰上或室溫融化。
2.在無(wú)菌條件下，向剛剛化凍的感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1μg需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰水浴中靜置10min。
3.將離心管置于液氮中速凍5min。（也可以用干冰和無(wú)水乙醇混合物代替液氮）
4.快速將離心管置于37℃水浴中保持5min，不要晃動(dòng)水面。
5.將離心管放回冰水浴中，再保持5min。
6.無(wú)菌條件下加入800μl無(wú)抗生素的2×YT或LB液體培養(yǎng)基，于28℃震蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。目的是使菌體復(fù)蘇并表達(dá)抗生素抗性。
7.5000rpm離心1min收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌體，加到相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌的細(xì)菌涂布器或玻璃珠將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。等平板中的液體完全吸收后，倒置平板，28℃培養(yǎng)2-3天。
注意事項(xiàng)：
1.感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。
2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
應(yīng)用[7][8]
GV3101感受態(tài)細(xì)胞可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體融合法選育紅曲菌Monacolin K高產(chǎn)株：
紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中含有一種膽固醇合成抑制劑-Monacolin K,它與土曲霉中發(fā)現(xiàn)的lovastatin系同一物質(zhì),都具有抑制生物體內(nèi)膽固醇合成途徑中關(guān)鍵酶HMG-CoA還原酶活性的作用,從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)異常血脂,由于歷史上紅曲產(chǎn)品具有可直接食用的特性,因此含Monacolin K的紅曲產(chǎn)品更為消費(fèi)者接受和喜愛(ài)。
建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅曲菌的方法,將攜帶遺傳標(biāo)記的T-DNA插入紅曲菌基因組中,改變紅曲菌遺傳信息的排列,影響其生長(zhǎng)和代謝,篩選高產(chǎn)Monacolin K突變轉(zhuǎn)化子;從高產(chǎn)Monacolin K紅曲菌突變株基因組中,根據(jù)已知的T-DNA兩端保守序列,擴(kuò)增出T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,從而尋找影響Monacolin K合成的帶T-DNA標(biāo)簽的突變基因,為研究紅曲菌Monacolin K合成功能基因組及代謝調(diào)控提供基礎(chǔ)信息;通過(guò)原生質(zhì)體融合的方式選育紅曲菌Monacolin K高產(chǎn)株并研究適合于遺傳改造變異株高產(chǎn)Monacolin K的發(fā)酵工藝,為紅曲菌工業(yè)化生產(chǎn)Monacolin K打下基礎(chǔ)。
構(gòu)建了含有g(shù)pdA啟動(dòng)子、潮霉素抗性基因hph和trpC終止子的雙元載體pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101;利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)成功將潮霉素抗性基因轉(zhuǎn)入發(fā)白紅曲菌(M.albidus)9901,實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了抗生素濃度,發(fā)白紅曲菌孢子濃度,根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞密度,共培養(yǎng)溫度和時(shí)間,以及乙酰丁香酮濃度等轉(zhuǎn)化條件,最終轉(zhuǎn)化效率可達(dá)520個(gè)轉(zhuǎn)化子/10~6個(gè)紅曲孢子。
對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行潮霉素抗性基因PCR鑒定,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)外源T-DNA已整合至轉(zhuǎn)化子的染色體基因組中。在諸多轉(zhuǎn)化子中,通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)篩選得到了一株比出發(fā)菌株發(fā)白紅曲菌9901高產(chǎn)Monacolin K的T-DNA插入突變轉(zhuǎn)化子H1。采用反向PCR方法對(duì)發(fā)白紅曲菌轉(zhuǎn)化子H1基因組T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行克隆,獲得了一段0.88 kb的DNA片段,暫命名為mkWL,對(duì)DNA片段mkWL進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)與NCBI公布的叢毛紅曲菌Monacolin K合成基因簇比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)與其中mkH基因(1.46 kb)部分基因序列同源性為97%。由此推斷基因mkWL包含發(fā)白紅曲菌Monacolin K合成關(guān)聯(lián)基因。
參考文獻(xiàn)
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[8]王璐.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體融合法選育紅曲菌Monacolin K高產(chǎn)株[D].江南大學(xué),2011.