背景[1-6]
LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的章魚(yú)堿型Ti質(zhì)粒pAL4404，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。
pAL4404型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：strep，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)104cfu/μg。
LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作說(shuō)明：
1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。
2.每100μl感受態(tài)加1ug（體積不大于10ul）質(zhì)粒DNA，用手管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。
3.加入700μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。
4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50ug/ml kan時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時(shí)加入50ug/ml kan，20ug/ml rif時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。
LBA4404感受態(tài)細(xì)胞注意事項(xiàng)：
1.感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化。
2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
應(yīng)用[7-9]
LBA4404感受態(tài)細(xì)胞用于微紫青霉菌菌株GXCR遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立：
從基因水平來(lái)研究絲狀真菌與重金屬間的相互作用具有重要的意義，近年來(lái)發(fā)展的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（ATMT）與傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法相比較，ATMT具有高效、穩(wěn)定、高頻單拷貝隨機(jī)插入、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的主要手段之一。基于本實(shí)驗(yàn)室工作曾分離得到一株高抗多種重金屬鹽并對(duì)苯菌靈敏感的微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR的良好基礎(chǔ)，研究將建立由根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的GXCR菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為從基因水平上研究該菌株對(duì)重金屬鹽抗性的可能機(jī)制提供基礎(chǔ)。
本研究在質(zhì)粒pGSA1252基礎(chǔ)上構(gòu)建了T-DNA區(qū)含有苯菌靈抗性基因（Benomylresistance）的雙元載體pG-Bn，通過(guò)三親轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，與稀釋至107個(gè)／ml的GXCR孢子共培養(yǎng)兩天后篩選得到具有苯菌靈抗性的轉(zhuǎn)化株367株，對(duì)隨機(jī)挑取的40株轉(zhuǎn)化株總DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，有98％的轉(zhuǎn)化株均能擴(kuò)增出目的片段，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了3．7個(gè)轉(zhuǎn)化株／10個(gè)小菌塊。
隨機(jī)挑選30個(gè)能擴(kuò)增出目的片段的轉(zhuǎn)化株中，有13個(gè)轉(zhuǎn)化株不能在CuSO4 PDA平板上生長(zhǎng)，9個(gè)轉(zhuǎn)化株的生長(zhǎng)明顯受CuSO4抑制。同時(shí)對(duì)表型明顯發(fā)生變化的轉(zhuǎn)化株總DNA進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果顯示62．5％的轉(zhuǎn)化株為T(mén)-DNA單拷貝整合插入，易于利用插入突變來(lái)分析相關(guān)基因的功能，為對(duì)微紫青霉菌菌株GXCR的抗重金屬遺傳機(jī)制的研究提供了寶貴的材料。
參考文獻(xiàn)
[1]Gene disruption in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by in vitro transposition[J].Guanggan Hu,James W.Kronstad.Current Genetics.2006(5)
[2]Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi[J].Caroline B.Michielse,Paul J.J.Hooykaas,Cees A.M.J.J.Hondel,Arthur F.J.Ram.Current Genetics.2005(1)
[3]Use of REMI and Agrobacterium-mediated transformation to identify pathogenicity mutants of the biocontrol fungus,Coniothyrium minitans[J].Christopher W.Rogers,Michael P.Challen,Jonathan R.Green,John M.Whipps.FEMS Microbiology Letters.2004(2)
[4]Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for random mutagenesis of Colletotrichum trifolii[J].Hiroyuki Takahara,Gento Tsuji,Yasuyuki Kubo,Mikihiro Yamamoto,Kazuhiro Toyoda,Yoshishige Inagaki,Yuki Ichinose,Tomonori Shiraishi.Journal of General Plant Pathology.2004(2)
[5]Negative selection using thymidine kinase increases the efficiency of recovery of transformants with targeted genes in the filamentous fungus Leptosphaeria maculans[J].Donald M.Gardiner,Barbara J.Howlett.Current Genetics.2004(4)
[6]Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis(AIM)of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana[J].Andreas Leclerque,Hong Wan,Anette Abschütz,Siwei Chen,Galina V.Mitina,Gisbert Zimmermann,Hans Ulrich Schairer.Current Genetics.2004(2)
[7]Cloning and targeted disruption,via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,of a trypsin protease gene from the vascular wilt fungus Verticillium dahliae[J].Katherine F.Dobinson,Sandra J.Grant,Seogchan Kang.Current Genetics.2004(2)
[8]玉榮.根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的微紫青霉菌菌株GXCR遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D].廣西大學(xué),2008.
[9]Stable transformants of the azaphilone pigment-producing Monascus purpureus obtained by protoplast transformation and Agrobacterium -mediated DNA transfer[J] . Sonia Campoy,Flor Pérez,Juan F. Martín,Santiago Gutiérrez,Paloma Liras. Current Genetics . 2003 (6)