背景[1-6]
Pierce Silver Stain for Mass Spectrometry是一套完整的試劑盒，用于快速靈敏地對(duì)聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行銀染，并對(duì)切除的凝膠塊進(jìn)行高效脫色，以進(jìn)行質(zhì)譜分析。
特性[1-6]
Pierce Silver Stain的特點(diǎn)：
•敏感和快速染色-低背景，易于使用的銀染提供亞納克敏感性，在固定后30分鐘內(nèi)檢測(cè)每個(gè)斑點(diǎn)小于0.25ng的蛋白質(zhì)
•靈活的染色方案-將凝膠固定15至30分鐘或過夜，對(duì)染色性能沒有任何影響;染色1至30分鐘（通常2至3分鐘）
•堅(jiān)固-有效的銀染，即使是難以染色的堿性蛋白質(zhì)，如溶菌酶（pI 10）和胰凝乳蛋白酶原A（pI 9.2），分別可檢測(cè)到0.2ng和0.5ng
•簡單，無故障的斑點(diǎn)制備-染色切除的凝膠塊中的斑點(diǎn)很容易脫色，并且可在一小時(shí)內(nèi)進(jìn)行胰蛋白酶消化。
•MS兼容的試劑和方案經(jīng)過優(yōu)化，可在從染色的1D或2D凝膠（SDS-PAGE）中提取肽后提供卓越的質(zhì)譜性能
•完整試劑盒-包含染色和脫色前所需的所有試劑，用于凝膠內(nèi)蛋白水解和肽回收，用于質(zhì)譜分析
•方便-kit-components在室溫下穩(wěn)定;節(jié)省寶貴的冰箱空間，無需在使用前平衡試劑
銀染法通常使用戊二醛或甲醛，其引起蛋白質(zhì)彼此和凝膠基質(zhì)的一些共價(jià)交聯(lián)。在發(fā)生這種交聯(lián)的程度上，將抑制從凝膠中提取或洗脫蛋白質(zhì)。Pierce Silver Stain在污漬和顯影劑工作溶液中使用甲醛。然而，優(yōu)化伴隨質(zhì)譜試劑盒的程序以化多肽回收而不會(huì)大大犧牲靈敏度。
應(yīng)用[7][8]
用于急性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組差異性表達(dá)的研究。
運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌蛋白質(zhì)組的差異性表達(dá)特征,篩選出骨骼肌組織中對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激具有重要意義的差異性表達(dá)的蛋白質(zhì),探討在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:10只雄性SD大鼠,按體重隨機(jī)配對(duì)分為安靜對(duì)照組（n=5）和運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)組（n=5）。運(yùn)動(dòng)組依據(jù)Bedford所建立的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型,運(yùn)動(dòng)至力竭。大鼠力竭后三小時(shí)和安靜組同時(shí)做麻醉后斷頭處死,進(jìn)行后肢腓腸肌蛋白質(zhì)提取和含量測(cè)定。提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過處理后進(jìn)行兩部分實(shí)驗(yàn)。章:急性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌蛋白質(zhì)差異性表達(dá)的初步研究。依次對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色、蛋白膠內(nèi)原位酶解、電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析;第二章:急性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌的比較蛋白質(zhì)組研究。依次對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行固相pH梯度—SDS雙向凝膠電泳、硝酸銀染色、蛋白質(zhì)膠內(nèi)原位酶解、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串連質(zhì)譜分析。
部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:組織蛋白提取比較成功,Bradford蛋白定量大約40ug.ul-1。電泳顯示36個(gè)條帶,與安靜組比較,在運(yùn)動(dòng)組有的條帶出現(xiàn)了明顯增寬、密度增高,有的條帶出現(xiàn)了明顯變窄、密度降低。對(duì)具有明顯變化的條帶進(jìn)行膠內(nèi)原位酶解和質(zhì)譜分析顯示第三條帶的運(yùn)動(dòng)組中出現(xiàn)了甲胎蛋白。第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果:安靜組和運(yùn)動(dòng)組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目分別為667±35個(gè)和572±28。共有282個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)后消失的蛋白質(zhì)點(diǎn)有88個(gè),運(yùn)動(dòng)后新增的蛋白質(zhì)點(diǎn)32個(gè),運(yùn)動(dòng)后表達(dá)量差異。
參考文獻(xiàn)
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[5]Role of the C-terminal domain of Bax and Bcl-xl in their localization and function in yeast cells.Priaut M,Camougrand N,Chaudhuri B,et al.FEBS Letters.1999
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[8]張松江.急性力竭運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組差異性表達(dá)的研究[D].湖南師范大學(xué),2006.