背景[1-6]
Thermo Scientific PageBlue Protein Staining Solution是一種靈敏，經(jīng)濟的膠體考馬斯G-250染料配方，用于聚丙烯酰胺凝膠和不含甲醇或乙酸的PVDF膜上蛋白質(zhì)的終點染色。
簡單的PageBlue蛋白質(zhì)染色溶液方案靈敏，高效，即使在過夜染色后也消除了過度染色凝膠的擔憂。這種蛋白質(zhì)染色劑的動態(tài)范圍為5至500ng，比傳統(tǒng)的考馬斯R-250染料靈敏度高約10倍。此外，PageBlue蛋白質(zhì)染色解決方案是經(jīng)濟的，因為它可以重復使用多達三次而不會有任何靈敏度損失。
特點[3-6]
PageBlue蛋白染色液的特點：
•易于使用-只需將凝膠浸泡在即用型溶液中，觀察染色條帶，不會脫色
•快速25至40分鐘方案
•安全-不含甲醇或乙酸
•動態(tài)范圍-線性動態(tài)范圍5至500ng
•經(jīng)濟-可重復使用3次
簡單的PageBlue蛋白質(zhì)染色溶液方案靈敏，高效，即使在過夜染色后也消除了過度染色凝膠的擔憂。這種蛋白質(zhì)染色劑的動態(tài)范圍為5至500ng，比傳統(tǒng)的考馬斯R-250染料靈敏度高約10倍。此外，PageBlue蛋白質(zhì)染色解決方案是經(jīng)濟的，因為它可以重復使用多達三次而不會有任何靈敏度損失。
應用[7][8]
用于可視化和量化在1D，2D和IEF聚丙烯酰胺凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉移到PVDF膜上后的染色。
在線粒體融合參與營養(yǎng)缺乏環(huán)境肝癌細胞糖代謝重編程調(diào)控的作用與機制研究中利用qrt-pcr與westernblot實驗,檢測營養(yǎng)缺乏環(huán)境下參與線粒體分裂/融合調(diào)控的關鍵分子及其上游信號分子的表達與活性,分析營養(yǎng)缺乏環(huán)境促進線粒體融合的分子機制。利用qrt-pcr、westernblot與gc-ms(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)技術,分析營養(yǎng)缺乏時線粒體融合對肝癌細胞糖酵解與氧化磷酸的調(diào)控。線粒體是調(diào)控細胞代謝最重要的細胞器,通過不斷地分裂/融合調(diào)控自身功能并對外界刺激做出適應性反應。
利用tem(透射電鏡)、bluenative-page、co-ip、qrt-pcr與westernblot技術,對營養(yǎng)缺乏時線粒體融合調(diào)控氧化磷酸化與糖酵解的機制進行研究。5.利用fcm(流式細胞術)與克隆形成實驗,分析營養(yǎng)缺乏時線粒體融合對肝癌細胞存活的影響。大量研究證實,線粒體分裂/融合異常與多種神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病及代謝性疾病的發(fā)生進展密切相關。近年來研究證實,多種類型腫瘤中線粒體分裂/融合發(fā)生異常,并參與腫瘤惡性進展。實體瘤常由于生長過快而導致內(nèi)部出現(xiàn)慢性營養(yǎng)缺乏微環(huán)境,腫瘤細胞需感知并通過代謝重編程做出適應才能繼續(xù)生存,而目前腫瘤適應營養(yǎng)缺乏的機制仍不十分清楚,闡明其機制對腫瘤防治具有重大意義。
我們前期研究發(fā)現(xiàn),營養(yǎng)缺乏環(huán)境時肝癌細胞線粒融合變長。作為細胞能量代謝調(diào)控核心的線粒體,其形態(tài)結構的變化是否參與肝癌細胞在營養(yǎng)缺乏時的代謝適應尚不清楚。
結果:
1.mito-tracker熒光染色證實營養(yǎng)缺乏促進肝癌細胞線粒體融合變長;透射電鏡(tem)對肝癌組織線粒體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),腫瘤中心區(qū)(營養(yǎng)缺乏)較邊緣區(qū)(營養(yǎng)充足)線粒體變長。
2.營養(yǎng)缺乏時,線粒體分裂/融合調(diào)控關鍵分子drp1、fis1、mfn1、mfn2與opa1表達均未發(fā)生顯著變化,而線粒體定位的drp1因被pka磷酸化(s637)而減少,導致線粒體變長。
3.營養(yǎng)缺乏時,線粒體融合促進肝癌細胞氧化磷酸而抑制糖酵解。
4.營養(yǎng)缺乏時,線粒體融合通過使線粒體嵴緊密促進氧化呼吸鏈復合體組裝,從而激活氧化磷酸化而抑制糖酵解;線粒體融合通過氧化磷酸化介導的nad+/sirt1/hif-1α信號抑制糖酵解。
5.線粒體融合抑制肝癌細胞在營養(yǎng)缺乏環(huán)境下的凋亡,促進肝癌細胞克隆形成能力。
6.營養(yǎng)缺乏誘導的線粒體融合促進腫瘤生長。
7.介導營養(yǎng)缺乏環(huán)境下線粒體融合的關鍵分子p-drp1s937表達水平與肝癌患者腫瘤分級、tnm分期及血清afp水平正相關,與患者預后顯著負相關性。
參考文獻
[1]Mitochondria and Cancer[J].Wei-Xing Zong,Joshua D.Rabinowitz,Eileen White.Molecular Cell.2016(5)
[2]Downregulation of fatty acid synthase complex suppresses cell migrationby targeting phospho?AKT in bladder cancer[J].Shuai?Shuai Zheng,Jian?Gang Gao,Zhi?Jun Liu,Xin?Hong Zhang,Shuai Wu,Bo?Wen Weng,You?Lin Wang,Si?Chuan Hou,Bo Jiang.Molecular Medicine Reports.2016(2)
[3]Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation[J].Timothy Wai,Thomas Langer.Trends in Endocrinology&Metabolism.2016(2)
[4]Mitochondrial dynamics,mitophagy and cardiovascular disease[J].César Vásquez‐Trincado,Ivonne García‐Carvajal,Christian Pennanen,Valentina Parra,Joseph A.Hill,Beverly A.Rothermel,Sergio Lavandero.J Physiol.2016(3)
[5]Key Roles of Glutamine Pathways in Reprogramming the Cancer Metabolism[J].Krzysztof Piotr Michalak,Agnieszka Ma?kowska-K?dziora,Bogus?aw Sobolewski,Piotr Wo?niak,Claudio Cabello-Verrugio.Oxidative Medicine and Cellular Longevity.2015
[6]Mitochondrial dynamics and quality control in Huntington’s disease[J].Pedro Guedes-Dias,Brígida R.Pinho,Tania R.Soares,Jo?o de Proen?a,Michael R.Duchen,Jorge M.A.Oliveira.Neurobiology of Disease.2015
[7]ATP Citrate Lyase(ACLY):A Promising Target for Cancer Prevention and Treatment[J].Amrita Devi Khwairakpam,Mayengbam Singh Shyamananda,Bethsebie Lalduhsaki Sailo,Sivakumar Raju Rathnakaram,Ganesan Padmavathi,Jibon Kotoky,Ajaikumar B.Kunnumakkara.Current Drug Targets.2015(2)
[8]李積彬.線粒體融合參與營養(yǎng)缺乏環(huán)境肝癌細胞糖代謝重編程調(diào)控的作用與機制研究[D].第四軍醫(yī)大學,2016.