背景及概述^[1]

組織總RNA大量純化試劑盒用于從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、組織樣本、血液、血漿、血清、細(xì)菌、酵母、真菌、植物和病毒中快速分離和純化總RNA。組織總RNA大量純化試劑盒可純化任何大小的RNA，從較大的mRNA和rRNA到miRNA和小干擾RNA(siRNA)。組織總RNA大量純化試劑盒無(wú)需使用苯酚或氯仿即可從蛋白等其他細(xì)胞組分中優(yōu)先純化出RNA。純化得到的RNA完整性高，適用于多種下游應(yīng)用，比如實(shí)時(shí)定量PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、Northern雜交、RNase保護(hù)、引物延伸及表達(dá)陣列分析。

組織總RNA大量純化試劑盒采用高效、專一結(jié)合核酸的硅膠膜離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖系統(tǒng)，可從動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞中快速提取總RNA，可同時(shí)處理大量不同樣品。操作簡(jiǎn)單方便，1小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，所提RNA純度高，沒(méi)有蛋白和其他雜質(zhì)污染。如果下游是對(duì)微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)，殘留的DNA可利用無(wú)RNase的DNase在柱上進(jìn)行消化去除，可用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)、RT-PCR、NorthernBlot、DotBlot、polyA篩選純化、real-timeRT-PCR、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

操作步驟^[1]

1.將組織在液氮中磨碎成粉沫。每20~30mg組織加600ulBufferRL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20mg加350ulBufferRL。樣品體積不超過(guò)BufferRL體積的十分之一。

2.樣品充分裂解后，室溫放置5min，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。

3.12000rpm離心2~5min，取上清進(jìn)行下步操作。

4.加入1倍體積（600ul或350ul）的70%乙醇（無(wú)RNase水配制），混勻。

5.將步驟4所得溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml）的吸附柱（SpinColumnCR）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

6.向吸附柱中加入350μlBufferRD，10000rpm離心15sec，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.配制DNaseI混合液：取52ulDEPC-H₂O，向其中加入8ul10×DNaseIBuffer和20ulDNaseI（1U/ul），混勻，配制成終體積為80ul的DNaseI混合液。

8.向吸附柱中直接加入80ulDNaseI混合液，20~30℃孵育15min。

9.向吸附柱中加入350ulBufferRD，10000rpm離心15sec，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入500ulBufferRW，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

11.重復(fù)步驟10。

12.12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。

13.將吸附柱置于一個(gè)新的無(wú)RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入30~50ulDEPC-H₂O，室溫放置1min，12000rpm離心1min，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

主要參考資料

[1] 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技巧全書(shū)·上冊(cè)