背景[1-6]
RNA純化試劑盒是用于純化并回收體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子和從各種材料中提取得到的總RNA，能有效地去除RNA樣品中污染的雜質(zhì)。本產(chǎn)品回收率可達(dá)80%，得到的RNA OD260/OD280比值一般為2.0左右，可以直接用于后續(xù)較敏感的實(shí)驗(yàn)（如微點(diǎn)陣分析、熒光RT-PCR等）。隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的不斷深入，RNA的類型，表達(dá)調(diào)控以及功能的復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超乎我們的想象。
去除含量占80%以上的核糖體RNA有助于將測(cè)序集中在含量少但信息大的RNA上。目前去除rRNA主要是通過探針和RNase H聯(lián)合使用的方式，處理后的RNA會(huì)混雜很多消化產(chǎn)物，酶和離子，不利于后續(xù)RNA文庫的構(gòu)建。以柱式RNA純化試劑盒為例Trizol是即用型的試劑，可用于從組織和細(xì)胞中純化總RNA。這是一種含酚和異硫氰酸胍的單相溶液，便于裂解組織和細(xì)胞，抑制RNA酶以保持RNA完整性。
Trizol總RNA純化試劑盒I結(jié)合了Trizol試劑盒硅膠膜技術(shù)，在20-40分鐘內(nèi)可從動(dòng)物組織、培養(yǎng)細(xì)胞、血液和植物樣本中分離RNA，與傳統(tǒng)的Trizol沉淀法相比，殘留的鹽分和蛋白更少。核酸純化柱可方便結(jié)合、洗滌和洗脫，因此可同時(shí)操作多個(gè)樣本。
與傳統(tǒng)的RNA分離技術(shù)不同，該柱無需異丙醇沉淀和乙醇洗滌等。樣本被Trizol試劑裂解。加入氯仿后，勻漿物通過離心分為水相和有機(jī)相。RNA分離至上層水相，而DNA分離至中層，蛋白分離至下層有機(jī)相。含RNA的水相加入乙醇后轉(zhuǎn)移至核酸純化柱，RNA結(jié)合到硅膠膜上，溶解的蛋白與PCR抑制物則被過濾除去。RNA經(jīng)Buffer WA和Buffer WBR洗滌液洗滌后，用RNase-Free Water洗脫得到純化RNA。洗脫的RNA長度在200 bp和10 kb之間，其中以tRNA為主。純化的RNA可直接用于RT-PCR、Northern blot、Dot blot、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，或保存于-70℃待后續(xù)使用。
特點(diǎn)：
可以回收20 nt以上的RNA；
操作簡單快速，只需要5分鐘；
回收率高達(dá)80%以上；
一站式，即開即用，操作簡單，用戶不需要自備任何試劑；
得到的RNA純度高，可以用于各種后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
應(yīng)用[7][8]
RNA純化試劑盒可用于各種樣本RNA提取實(shí)驗(yàn)中的純化：
抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)也稱為肽類抗生素(Peptideantibiotics)或天然抗生素(Natural antibiotics),是一類對(duì)細(xì)菌、真菌等微生物及某些昆蟲和動(dòng)植物細(xì)胞具有抑制作用的小分子多肽。研究抗菌肽為開發(fā)新的抗菌素、抗病毒和腫瘤抑制劑開辟了廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在從銀杏果仁中分離純化出一種抗菌肽、對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究,并建立從銀杏種仁中反轉(zhuǎn)錄克隆cDNA的方法體系,為克隆基因和研究其抗菌機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)以銀杏種仁為研究材料,以常壓柱層析法、離心式離子交換層析加電洗法脫、AKTA柱層析法等三種方法從銀杏種仁中提取出一種抗菌肽,并對(duì)其純度、分子量、抗菌活性、熱穩(wěn)定性、對(duì)極端pH值的抗性、對(duì)高鹽濃度的抗性等性質(zhì)進(jìn)行了分析。通過異硫氰酸胍法、TRIzoL法,CTAB法以及SDS法分別提取銀杏種仁的總RNA,建立反轉(zhuǎn)錄體系。主要獲得以下結(jié)果:1、三種方法純化出銀杏種仁抗菌肽,此蛋白在SDS-PAGE上顯示單條帶,表觀分子量為13000Da。AKTA柱層析法所得蛋白在雙向電泳中達(dá)
到單點(diǎn)純。2、該蛋白在離子交換層析中以高鹽濃度被洗脫,是一種堿性蛋白。對(duì)照其雙向電泳圖譜,其等電點(diǎn)在9.8左右。3、純化的蛋白對(duì)黃瓜鐮刀孢菌(Fusarium oxysporum)辣、椒早疫病菌(Alternariasolani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinereaPers)、黃瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)等14種真菌有抑制作用。4、該蛋白濃度達(dá)到2.5mg/ml以上即表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。具有較高熱穩(wěn)定性,在90℃處理30min對(duì)黃瓜鐮刀孢菌抑菌活性無明顯變化。在酸性條件下,對(duì)供試的黃瓜鐮刀孢菌有很強(qiáng)的抑菌活性。對(duì)革蘭氏陽性菌代表菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌代表菌大腸桿菌均有一定的抑制作用。5、CTAB法提取得總RNA純度高,完整性好,可用于反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)
[1]Antifungal proteins:targets,mechanisms and prospective applications[J].T.Theis,U.Stahl.Cellular and Molecular Life Sciences.2004(4)
[2]A novel procedure for separating small peptides on polyacrylamide gels[J].Kwabena Sarfo,Greg B.G.Moorhead,Raymond J.Turner.Letters in Peptide Science.2003(2)
[3]A method for isolating total RNA from pear leaves[J].M.Malnoy,J.P.Reynoird,F.Mourgues,E.Chevreau,P.Simoneau.Plant Molecular Biology Reporter.2001(1)
[4]A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J].Evi Kiefer,Werner Heller,Dieter Ernst.Plant Molecular Biology Reporter.2000(1)
[5]A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit[J].Mehar H.Asif,Puneet Dhawan,Pravendra Nath.Plant Molecular Biology Reporter.2000(2)
[6]Characterization and cDNA cloning of two glycine-and histidine-rich antimicrobial peptides from the roots of shepherd’s purse,Capsella bursa-pastoris[J].Chong Jing Park,Chan Bae Park,Seung-Suh Hong,Hyun-Soo Lee,Sang Yeol Lee,Sun Chang Kim.Plant Molecular Biology.2000(2)
[7]An Improved RNA Isolation Method for Plant Tissues Containing High Levels of Phenolic Compounds or Carbohydrates[J].R.A.Salzman,T.Fujita,K.Zhu-Salzman,P.M.Hasegawa,R.A.Bressan.Plant Molecular Biology Reporter.1999(1)
[8]荊貝貝.銀杏種仁抗菌肽的分離純化、性質(zhì)鑒定及其總RNA提取[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.