產(chǎn)品描述
 

Hieff NGS^® mRNA Isolation Master Kit是翊圣生物自主研發(fā)的專門用于純化mRNA的磁珠試劑盒。其中的mRNA Capture beads為偶聯(lián)了Oligo（dT）的微米級順磁性微球，通過與帶有poly（A）尾巴的mRNA相結(jié)合，將mRNA從0.1-4 μg完整度良好的總RNA中進行分離純化。

產(chǎn)品組分
 

運輸與保存方法
 

冰袋運輸。

2-8℃保存，有效期一年。避免冷凍！

使用方法
 

一、 自備材料
 

磁力架，Nuclease-free離心管。

二、操作流程
 

圖1 mRNA純化試劑盒操作流程

二、 操作步驟
 

3.1 實驗前準備
 

將mRNA Capture Beads從4℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫（約30 min）。

3.2 樣本準備
 

① 在一個Nuclease-free PCR管中，用Nuclease-free water將0.1-4 μg總RNA稀釋至50 μL。

② 將稀釋的RNA置于PCR儀中，65℃，5 min；4℃，hold，使RNA變性，冰上放置備用。 

3.3 mRNA與磁珠的結(jié)合


       ① 顛倒或渦旋振蕩混勻磁珠，吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL 的變性RNA樣品中，用移液器反復吹打6次，使其充分混勻。

② 室溫孵育5 min，使mRNA與磁珠完全結(jié)合。

③ 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，使mRNA與總RNA分離，吸除全部上清。

3.4 樣本的洗滌
 

① 將樣品從磁力架上取出，加入200 μL Beads Wash Buffer，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

② 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，吸除全部上清。

③ 重復上一步驟，共洗滌兩次。

3.5 mRNA樣本輪洗脫
 

① 將樣品從磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

② 將樣品放置于PCR儀中，80℃，2 min；25℃，hold，將mRNA洗脫下來。

3.6 mRNA與磁珠的再次結(jié)合

① 加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反復吹打6次以徹底混勻。

② 室溫孵育5 min，使mRNA結(jié)合到磁珠上。

③ 將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min，小心移除上清。

3.7 樣本的洗滌
 

將樣品從磁力架上取出，加入200 μL Beads Wash Buffer，用移液器反復吹打6次徹底混勻，將樣品重新放回至磁力架中，室溫靜置5 min，然后吸除全部上清。

【注】：最后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。

3.8 mRNA樣本終洗脫
 

方案一：用于逆轉(zhuǎn)錄反應。

將樣品從磁力架上取出，加入12 μL Nuclease-free water重懸磁珠，用移液器吹打6次以徹底混勻。將樣品置于PCR儀中80℃，2 min后，立即置于磁力架上，室溫靜置5 min。待溶液澄清后，小心吸取10 μL上清至另一新的Nuclease-free PCR管中。

方案二：用于RNA文庫的構(gòu)建。

可根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書加入相應體積的Frag/Primer Buffer，進行文庫構(gòu)建。

【注】：樣品可置于冰上繼續(xù)進行NGS文庫構(gòu)建或其他分析應用（建議立即進行后續(xù)反應），也可以置于-80℃保存。