背景^[1-6]

cfDNA Clean Beads是基于一種固相載體可逆化固定（SPRI）的分離純化方法。磁珠體系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及鹽離子等，在一定濃度的PEG和鹽離子環(huán)境中，DNA可吸附到羧基修飾的高分子磁珠表面（即固相載體），該過程是可逆的，在適當條件下，結合的DNA分子可以被洗脫回收。

納米級別的磁珠表面性質不同，分離原理也不盡相同，但基本上固態(tài)的球狀材料組成并無太大差異，基礎結構一般分為3層，最內層的核心是聚苯乙烯、第二層包裹磁性物質——四氧化三鐵（Fe3O4），最外層表面是羧基（-COOH）修飾的高分子材料所構成，其中羧基行使與核酸結合的工作。在整個體系中，PEG是影響DNA回收的決定性因素（其他因素還包括DNA大小和濃度、鹽離子濃度、孵育時間等等）。DNA在一定濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl2促進條件下，使DNA發(fā)生脫水反應，分子構象會發(fā)生急劇變化，由線狀被壓縮形成卷曲球狀，繼而聚集沉淀，同時隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，不同長度的DNA可以被選擇性的沉淀出來。

在磁珠體系中，特定分子量的PEG的功能主要是與鹽離子共同作用，改變不同長度DNA的分子構象，同時增加體系的粘稠程度，使磁珠存在其中處于懸浮狀態(tài)，不易沉降，增加磁珠在空間位置的碰撞與排斥，從而增加核酸與磁珠的聚集效率與效果，除此之外，PEG與蛋白質具有相容性，也可去除樣品中的蛋白質。cfDNA提取過程中，常會引入大片段DNA或gDNA的污染。常規(guī)情況下，這些污染物可以通過對目的片段進行磁珠分選回收而去除。但是，由于cfDNA僅有170 bp左右，常用的AMPure XP或SPRI Select磁珠對100-200 bp的回收效率較低，無法獲得理想的cfDNA回收效果。

Hieff NGSTM cfDNA Clean Beads(100-200 bp)是針對上述問題的解決而專門設計的磁珠類產品，其基于SPRI(Solid Phase Reverse Immobilization)原理制備，配合精心優(yōu)化的緩沖體系和已經驗證的操作體系，可精確回收100-200 bp cfDNA，有效去除大片段DNA和gDNA的污染，同時具有操作簡單、回收率高（>95%）等優(yōu)勢。使用本品獲得的cfDNA產物，可直接應用二代測序文庫構建、克隆、酶切、連接等反應。本產品中提供的所有試劑組分均經過嚴格質檢，zui高程度保障產品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。

注意事項：

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2）磁珠使用前須在室溫平衡至少30 min。

3）80%乙醇需現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

4）進行長度分選時，初始樣品體積需≥50μL，不足時請用超純水補齊。樣品體積太小，將導致移液誤差增大，進而影響分選的準確性。

使用方法：

1.準備工作

將磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2.長度分選（雙輪法）

1）請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

2）根據要求，參考表1向DNA溶液中加入輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

3）室溫孵育5 min。

4）將離心管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉移上清到干凈的離心管中?！咀⒁猓恨D移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質量?！?/p>

5）向上清中加入第二輪分選磁珠。

6）渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

7）將離心管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

8）保持EP管始終處于磁力架中，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

9）重復步驟8。

10）保持離心管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

11）將離心管從磁力架中取出，加入適量ddH2O（≥20μL），渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

12）將離心管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心吸取上清至干凈的管中，即完成純化。

應用^[7][8]

cfDNA 清理磁珠可用于cfDNA提取實驗的純化：

新一代分析技術總的發(fā)展方向是更加微型化、自動化、快速化和集成化,而近幾年出現(xiàn)的微流控分析(Microfluidic analysis)正是為實現(xiàn)這一目標服務的主要領域之一。微流控分析在其發(fā)展過程中結合了越來越多的技術,而這些技術又推動了微流控分析領域的不斷發(fā)展。比如磁場和磁性粒子與微流控系統(tǒng)的結合,雖然時間并不長,但已在分離分選、控制、捕獲、傳輸和混合上得到很多應用,遍及生物、醫(yī)藥、化學、物理、藥物等各個領域。

在微流控芯片上使用磁珠提取DNA已經有了很多的報道,集成化程度也很高,但是芯片系統(tǒng)加工比較繁瑣。本工作的主要內容是建立基于毛細管的微流控磁珠DNA提取系統(tǒng)。章介紹了在微流控領域利用磁性物質和磁場進行微流控操作的進展領域結合產生的功能及其主要運用。第二章中介紹了基于毛細管的微流控磁珠DNA提取系統(tǒng)。系統(tǒng)基于毛細管構建,結構簡單,不需采用昂貴的微加工設備和復雜的微加工技術。系統(tǒng)采用重力驅動液流,操作方便。系統(tǒng)被應用于全血中DNA的提取。

參考文獻

[1]Application of Superhydrophobic Surface with High Adhesive Force in No Lost Transport of Superparamagnetic Microdroplet.X.Hong,X.F.Gao,L.Jiang.Journal of the American Chemical Society.2007

[2]Magnetic levitation of microdroplets in air.V.Haguet,C.Jeandey,H.Chetouani,G.Reyne,F.Chatelain.μTAS 2006.

[3]J Microelectromagnet for magnetic manipulation in lab-on-a-chip systems.K.Smistrup,P.T.Tang,O.Hansen,M.F.Hansen.Journal of Magnetism and Magnetic Materials.2006

[4]Cofabrication of Electromagnets and Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).A.C.Siegel,S.S.Shevkoplyas,D.B.Weibel,D.A.Bruzewicz,A.W.Martinez,G.M.Whitesides.Angewandte.2006

[5]A microfabricated bio-magnetic separator based Micro Total Analysis Systems.N.Chronis,W.Lam,L.Lee..2001

[6]Self-Assembly of Colloidal Pyramids in Magnetic Fields.L.E.Helseth.Langmuir.2005

[7]Colloidal Rings in a Liquid Mixture.L.E.Helseth,RM.Muruganathan,Y.Zhang,T.M.Fischer.Langmuir.2005

[8]沈玉勤. 基于毛細管的磁珠微流控DNA富集提取系統(tǒng)的研究[D].浙江大學,2007.